【摘 要】
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隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)和十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis)为3种重要的人兽共患肠道原虫,能够感染包括人在内的多种动物。3种寄生虫可以通过水或食物进行传播,人和动物可通过饮用被包囊或卵囊污染的水和食物而感染,引起自限性腹泻、腹痛和营养不良等症状。当前,3种肠道原虫引起的疾病已成为全
【基金项目】
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吉林省教育厅科学技研究项目(JJKH20210366KJ); 国家重点研发计划课题(2017YFD0500401); 宁夏回族自治区科技支撑计划[宁农科(2016)1号]; 上海市科技兴农项目(G2019-02-08-00-08-F01151)、[沪农科创字(2019)第3-3号]、[沪农科攻字(
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隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)和十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis)为3种重要的人兽共患肠道原虫,能够感染包括人在内的多种动物。3种寄生虫可以通过水或食物进行传播,人和动物可通过饮用被包囊或卵囊污染的水和食物而感染,引起自限性腹泻、腹痛和营养不良等症状。当前,3种肠道原虫引起的疾病已成为全球面临的重要公共卫生问题,一些地方经常出现3种寄生虫疾病的爆发,造成严重的公共卫生事件,给人的健康带来威胁,同时也给畜牧业经济带来重大损失。然而,目前并没有3种寄生虫病的有效药物和疫苗,一旦形成大规模传播,会给人类安全带来重大的危害。因此,疾病的快速发现、及早预防,仍是当前控制3种寄生虫病的重要方法。目前,3种寄生虫的检测方法多数仍是单种寄生虫的分别检验,这样不仅耗时、耗力,而且延误最佳的疾病预防和控制时间。建立3种寄生虫的多重诊断方法,能够减少检测时间、降低检测成本,对于寄生虫感染的及早发现、及早控制具有重要意义。为达到快速检测、及早发现3种寄生虫感染的目的,本文首先筛选针对3种肠道原虫的特异性引物,进行PCR扩增和条件优化,成功建立了针对3种寄生虫的多重PCR检测方法。对该方法进行了反应条件的优化和筛选,发现最适退火温度为57℃,具有良好的特异性,仅能够扩增上述3种寄生虫的DNA,而不能扩增犬新孢子虫(Neospora caninum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、鼠巴贝斯虫(Babesia rattus)和日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的基因组DNA;敏感性实验发现,建立的方法对3种寄生虫均有较高的敏感性,其中隐孢子虫和十二指肠贾第鞭毛虫DNA的最低检测限均为100 fg/μL,而毕氏肠微孢子虫的最低检测限为1 pg/μL。为验证建立的多重PCR检测方法的有效性,对从新疆伊犁地区3个县采集的180份骆驼粪便样品进行了多重PCR检测,同时,采用PCR方法对3种肠道原虫进行分别检测,比较二者检测结果的一致性。结果表明,应用单重PCR方法检测,隐孢子虫的阳性率为8.89%,毕氏肠微孢子虫的阳性率为32.7%,十二指肠贾第鞭毛虫的阳性率为1.67%;多重PCR检测结果与单重PCR的检测结果一致。对阳性样品进行测序鉴定,发现骆驼感染的隐孢子虫虫种为微小隐孢子虫(C.parvum)和安氏隐孢子虫(C.andersoin);毕氏肠微孢子虫的基因型为Macaque I、CAM I、SH deer I和J;贾第虫的基因型为A和C。当前,该3种寄生虫尚无有效的治疗药物和预防疫苗,因此,很多研究聚焦于抗3种寄生虫药物的筛选。本研究以实验室保有的泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)为感染虫种,进行抗隐孢子虫的药物初步筛选。应用口服灌胃的方法,进行了阿奇霉素、青蒿浸膏和抗菌肽的抗隐孢子虫试验,通过小鼠增重率,减卵囊率和肠道病理变化等3方面进行药物的抗隐孢子虫效果评价。结果显示,阿奇霉素组的减卵囊率最高,为67.93%;抗菌肽组与青蒿浸膏组相似,减卵囊率分别为56.36%和52.87%。对小鼠增重率的评价,发现抗菌肽增重效果最好(36.71%),其次是青蒿浸膏(31.91%),二者均高于健康组(25.00%),而阿奇霉素效果最差(5.75%),甚至低于感染对照组(14.58%)。病理切片变化趋势与减卵囊率和小鼠增重率结果相似。综上,本研究建立了隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和十二指肠贾第鞭毛虫3种肠道原虫的多重PCR检测方法,具有良好的敏感性和特异性。应用该方法对新疆伊犁地区采集的骆驼粪便样品进行了检测,检测结果与单重PCR检测结果一致。骆驼粪便中存在上述3种原虫的人兽共患虫种或基因型。进行了阿奇霉素、青蒿浸膏和抗菌肽的抗隐孢子虫效果评价,发现阿奇霉素组减卵率最高,但增重效果最差;而抗菌肽组对小鼠肠道的保护性最好,且给药剂量显著低于阿奇霉素,具有潜在的抗隐孢子虫作用。研究结果为有效防控该3种重要人兽共患寄生虫感染,保护人畜健康提供了基础。
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