三种致腹泻肠道原虫多重检测方法的建立及抗隐孢子虫药物的初步筛选

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隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)和十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis)为3种重要的人兽共患肠道原虫,能够感染包括人在内的多种动物。3种寄生虫可以通过水或食物进行传播,人和动物可通过饮用被包囊或卵囊污染的水和食物而感染,引起自限性腹泻、腹痛和营养不良等症状。当前,3种肠道原虫引起的疾病已成为全球面临的重要公共卫生问题,一些地方经常出现3种寄生虫疾病的爆发,造成严重的公共卫生事件,给人的健康带来威胁,同时也给畜牧业经济带来重大损失。然而,目前并没有3种寄生虫病的有效药物和疫苗,一旦形成大规模传播,会给人类安全带来重大的危害。因此,疾病的快速发现、及早预防,仍是当前控制3种寄生虫病的重要方法。目前,3种寄生虫的检测方法多数仍是单种寄生虫的分别检验,这样不仅耗时、耗力,而且延误最佳的疾病预防和控制时间。建立3种寄生虫的多重诊断方法,能够减少检测时间、降低检测成本,对于寄生虫感染的及早发现、及早控制具有重要意义。为达到快速检测、及早发现3种寄生虫感染的目的,本文首先筛选针对3种肠道原虫的特异性引物,进行PCR扩增和条件优化,成功建立了针对3种寄生虫的多重PCR检测方法。对该方法进行了反应条件的优化和筛选,发现最适退火温度为57℃,具有良好的特异性,仅能够扩增上述3种寄生虫的DNA,而不能扩增犬新孢子虫(Neospora caninum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、鼠巴贝斯虫(Babesia rattus)和日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的基因组DNA;敏感性实验发现,建立的方法对3种寄生虫均有较高的敏感性,其中隐孢子虫和十二指肠贾第鞭毛虫DNA的最低检测限均为100 fg/μL,而毕氏肠微孢子虫的最低检测限为1 pg/μL。为验证建立的多重PCR检测方法的有效性,对从新疆伊犁地区3个县采集的180份骆驼粪便样品进行了多重PCR检测,同时,采用PCR方法对3种肠道原虫进行分别检测,比较二者检测结果的一致性。结果表明,应用单重PCR方法检测,隐孢子虫的阳性率为8.89%,毕氏肠微孢子虫的阳性率为32.7%,十二指肠贾第鞭毛虫的阳性率为1.67%;多重PCR检测结果与单重PCR的检测结果一致。对阳性样品进行测序鉴定,发现骆驼感染的隐孢子虫虫种为微小隐孢子虫(C.parvum)和安氏隐孢子虫(C.andersoin);毕氏肠微孢子虫的基因型为Macaque I、CAM I、SH deer I和J;贾第虫的基因型为A和C。当前,该3种寄生虫尚无有效的治疗药物和预防疫苗,因此,很多研究聚焦于抗3种寄生虫药物的筛选。本研究以实验室保有的泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)为感染虫种,进行抗隐孢子虫的药物初步筛选。应用口服灌胃的方法,进行了阿奇霉素、青蒿浸膏和抗菌肽的抗隐孢子虫试验,通过小鼠增重率,减卵囊率和肠道病理变化等3方面进行药物的抗隐孢子虫效果评价。结果显示,阿奇霉素组的减卵囊率最高,为67.93%;抗菌肽组与青蒿浸膏组相似,减卵囊率分别为56.36%和52.87%。对小鼠增重率的评价,发现抗菌肽增重效果最好(36.71%),其次是青蒿浸膏(31.91%),二者均高于健康组(25.00%),而阿奇霉素效果最差(5.75%),甚至低于感染对照组(14.58%)。病理切片变化趋势与减卵囊率和小鼠增重率结果相似。综上,本研究建立了隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和十二指肠贾第鞭毛虫3种肠道原虫的多重PCR检测方法,具有良好的敏感性和特异性。应用该方法对新疆伊犁地区采集的骆驼粪便样品进行了检测,检测结果与单重PCR检测结果一致。骆驼粪便中存在上述3种原虫的人兽共患虫种或基因型。进行了阿奇霉素、青蒿浸膏和抗菌肽的抗隐孢子虫效果评价,发现阿奇霉素组减卵率最高,但增重效果最差;而抗菌肽组对小鼠肠道的保护性最好,且给药剂量显著低于阿奇霉素,具有潜在的抗隐孢子虫作用。研究结果为有效防控该3种重要人兽共患寄生虫感染,保护人畜健康提供了基础。
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