骨癌痛(bone cancer pain, BCP)是严重影响癌症患者生活质量的最主要因素，在目前的治疗手段下，仍有45%的患者未得到有效的镇痛，这至少部分与未阐明骨癌痛的机制有关。质子(H+)敏感的T细胞死亡偶联基因8(T-cell death associated gene8,TDAG8)可表达于脊髓及背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)等处，且可参与炎性痛的过程。BCP并不完全同于炎性痛，BCP中常伴有组织酸化的过程，应可激活TDAG8，但目前尚鲜见TDAG8直接参与BCP的报道。本研究拟在建立的大鼠BCP模型中，首先观察TDAG8及其下游蛋白在BCP大鼠脊髓背角中的表达变化，然后采用基因干扰技术下调TDAG8的表达，观察其对BCP大鼠痛行为学及其下游蛋白表达的影响，进一步采用神经药理学的方法研究TDAG8下游两条信号通路是否参与了BCP的过程。该研究将为研发以TDAG8为镇痛靶位的新药物，更彻底地治疗癌痛奠定基础。第一部分：大鼠胫骨癌痛模型的建立目的建立大鼠胫骨癌痛模型。方法雌性SD大鼠，随机分为normal组、sham组、BCP组。BCP组大鼠左胫骨骨髓腔注入Walker256（1×105）肿瘤细胞，sham组大鼠左胫骨骨髓腔注入等体积的热杀死肿瘤细胞悬液，normal组不作任何处理。观察各组大鼠种瘤前及种瘤后1、3、6、9、12、15、18d行走痛评分（ambulatory score，AS）、von Frey触诱发痛阈值（paw withdrawal threshold，PWT)(n=8)。X摄片及HE染色观察normal组、sham组及BCP组种瘤后6、12、18d骨结构破坏及增生反应情况(n=3)。结果normal组与sham组相比, AS及PWT在各时间点差异无统计学意义。与normal组及sham组相比，BCP组在种瘤后6～18d，AS评分逐渐进行性地增加，PWT逐渐进行性地降低，差异有统计学意义。BCP组X摄片显示，种瘤后6d胫骨近骺端骨小梁缺损；种瘤后12d多处骨小梁缺损，甚至破坏至骨皮质；种瘤后18d近骺端及骨皮质破坏进一步加重，甚至有骨质缺损。HE染色显示，BCP组种瘤后6、12d胫骨骨小梁有不同程度的破坏，种瘤后18d可见骨结构缺失、骨小梁破坏严重，肿瘤细胞充满骨髓腔，严重的可见肿瘤细胞穿破骨皮质及骨膜。结论成功建立了SD大鼠胫骨癌痛模型。第二部分：胫骨癌痛大鼠脊髓背角TDAG8及其下游的PKA、CREB、PKC和ERK1/2蛋白表达的变化目的观察胫骨癌痛大鼠脊髓背角TDAG8及其下游的PKA、CREB、PKC和ERK1/2蛋白表达的变化。方法取normal组、sham组、BCP6d、BCP12d、BCP18d大鼠L4～6脊髓背角，用免疫荧光、real-time PCR及Western blot测定大鼠脊髓背角TDAG8的表达变化,用Western blot测定大鼠脊髓背角PKA、CREB、PKC和ERK1/2的表达变化。结果与normal组和sham组相比，BCP组大鼠在种瘤后6、12、18d脊髓背角TDAG8阳性神经元数目逐渐增加，TDAG8mRNA及蛋白表达水平也逐渐升高。BCP组大鼠脊髓背角中PKAca、 p-CREB、p-PKCγ及p-ERK1/2蛋白的表达水平也较对照组明显提高。结论胫骨癌痛大鼠脊髓背角TDAG8及其下游的PKA、CREB、PKC和ERK1/2蛋白的表达水平均明显上调。第三部分： SiRNA抑制大鼠脊髓背角神经细胞TDAG8的表达目的观察化学合成的siRNA对大鼠脊髓背角神经细胞（rat neurons-dorsal spinalcord cells, RNdsc）上TDAG8表达的影响。方法设计并合成针对TDAG8的siRNA3对（siRNA63，siRNA341，siRNA897）及一条带绿色荧光标记的阴性对照siRNA。在阳离子聚合物纳米粒jetPEI介导下转染RNdsc。将RNdsc细胞随机分为正常（normal）组，载体（vehicle）组，阴性对照(mismatch)组，siRNA50、100、200pmol组。转染24h后，荧光显微镜下计算转染复合物的转染效率，用MTT法检测转染复合物的细胞毒性，用real-time PCR及Western blot测定siRNA-pool的干扰效率。结果采用jetPEI作为转染介质转染效率高，达92.9%。转染复合物的细胞毒性低，各组细胞成活率差异无统计学意义。siRNA50、100、200pmol可剂量依赖性地抑制TDAG8的表达，siRNA200pmol组可抑制TDAG8mRNA表达达88%，抑制蛋白的表达达73%。结论化学合成的siRNA能高效地抑制RNdsc上TDAG8的表达。第四部分：鞘内注射siRNA对大鼠骨癌痛的影响目的观察不同时间点鞘内注射TDAG8-siRNA对大鼠骨癌痛的影响。方法实验分为预处理组和处理组，每组又分为5个亚组：sham、BCP+NS、BCP+mismatch、BCP+vehicle及BCP+siRNA组。预处理组和处理组分别在种瘤后3d及6d开始鞘内给药，1次/d，连续3d。BCP+NS、BCP+mismatch、BCP+vehicle及BCP+siRNA组分别鞘内注射NS、mismatch、vehicle及siRNA，各组鞘内给药的容积均为10μl，siRNA的剂量为3μg/次。sham组鞘内给药同BCP+NS组。观察各组给药前后的痛行为学变化（n=8）。Real-time PCR及Western blot测定鞘内给药24h后,脊髓背角TDAG8的表达变化及用Western blot测定其下游PKA、 CREB、PKC和ERK1/2蛋白的表达变化（n=4）。结果在预处理组鞘内注射TDAG8-siRNA可抑制骨癌痛的发生,在处理组鞘内注射TDAG8-siRNA可缓解骨癌痛，但不能完全逆转之。在预处理组和处理组中，鞘内注射TDAG8-siRNA可显著抑制脊髓背角TDAG8mRNA和蛋白的表达，可显著抑制其下游PKA、 CREB、PKC和ERK1/2蛋白的表达。结论鞘内注射TDAG8-siRNA可明显缓解BCP大鼠的骨癌痛，同时抑制脊髓背角TDAG8及其下游蛋白的表达。第五部分:TDAG8-PKA-CREB信号转导通路在大鼠骨癌痛中的作用目的研究TDAG8-PKA-CREB信号转导通路在大鼠骨癌痛中的作用。方法实验分为鞘内注射H-89和鞘内注射TDAG8-siRNA两大实验组。鞘内注射H-89实验组：种瘤后9d的BCP大鼠，随机分为生理盐水（NS）组、二甲亚砜（DMSO）组及H-89组（n=8）。NS组及DMSO组分别鞘内注射NS及DMSO，H-89组鞘内注射H-89（8nmol），各组鞘内注射的容积均为10μl。观察各组鞘内给药前及鞘内给药后15、30、45min的AS及PWT变化。 Western blot测定各组鞘内给药1h后脊髓背角PKAca及p-CREB的表达水平。鞘内注射TDAG8-siRNA实验组：实验分组与方法同第二、第四部分。结果骨癌痛大鼠脊髓背角中PKAca及p-CREB蛋白的表达水平明显增加。鞘内注射TDAG8-siRNA在减轻BCP大鼠痛行为学的同时可降低脊髓背角PKAca及p-CREB的表达。鞘内注射H-89显著减轻BCP大鼠痛行为学且可明显抑制脊髓背角PKAca及p-CREB的表达。结论TDAG8-PKA-CREB信号转导通路可能参与了大鼠骨癌痛的过程。第六部分:TDAG8-PKC-ERK信号转导通路在大鼠骨癌痛中的作用目的研究TDAG8-PKC-ERK信号转导通路在大鼠骨癌痛中的作用。方法实验分为鞘内注射GF109203X和鞘内注射TDAG8-siRNA两大实验组。鞘内注射GF109203X实验组：种瘤后9d的BCP大鼠，随机分为生理盐水（NS）组、二甲亚砜（DMSO）组及GF109203X组（n=8）。NS组及DMSO组分别鞘内注射NS及DMSO，GF109203X组鞘内注射GF109203X（0.4nmol），各组鞘内注射的容积均为10μl。观察各组鞘内给药前及鞘内给药后60、120、180min的AS及PWT变化。Western blot测定各组鞘内给药3h后脊髓背角p-PKCγ及p-ERK1/2的表达水平。鞘内注射TDAG8-siRNA实验组：实验分组与方法同第二、第四部分。结果骨癌痛大鼠脊髓背角中p-PKCγ及p-ERK1/2蛋白的表达水平明显增加。鞘内注射TDAG8-siRNA在减轻BCP大鼠痛行为学的同时可降低脊髓背角p-PKCγ及p-ERK1/2的表达。鞘内注射GF109203X显著减轻BCP大鼠痛行为学且可明显抑制脊髓背角p-PKCγ及p-ERK1/2的表达。结论TDAG8-PKC-ERK信号转导通路可能参与了大鼠骨癌痛的过程。