论文部分内容阅读
猪链球菌2型(Streptococcus suis Serotype 2, S. suis 2)编码谷氨酰胺合成酶及其转录调控因子的基因分别是glnA和glnR。通过构建glnA和glnR的基因缺失株ΔGlnA和ΔGlnR,分别感染CD1小鼠发现突变株ΔGlnR和ΔGlnA毒力都有所下降,且ΔGlnA毒力下降非常显著,在各组织器官活菌数与野生株相比显著降低。这些结果说明谷氨酰胺合成酶在猪链球菌2型感染过程中,尤其在粘附和定植过程中发挥着重要的作用。通过生物信息学分析,在乌头酸酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶操纵子启动子区发现了GlnR结合的保守序列,而异柠檬酸脱氢酶的产物α-酮戊二酸又可以在谷氨酸脱氢酶的作用下生成谷氨酸,和谷氨酰胺代谢相关。因此,我们推测谷氨酰胺代谢和三羧酸循环(TCA循环)中有着一定的联系。本研究以猪链球菌2型SC19为亲本菌株,开展了如下工作：1. GlnR和GlnA原核表达、纯化及GlnA的体外定点突变参考NCBI的Genbank中猪链球2型05ZYH33基因组序列,以SC19的基因组DNA为模板,PCR分别扩增glnA和glnR基因,将扩增的基因连接到原核表达载体pET28a,构建了表达质粒pET28a-glnR、pET28a-glnA。预测了GlnA的可能关键氨基酸位点且通过重叠延伸PCR介导的定点突变将GlnA的54、67、133和308位氨基酸进行了定点突变,同样构建原核表达载体后转化到大肠杆菌表达菌株BL21中,经诱导表达,得到了目的蛋白。将目的蛋白纯化并检测GlnA及氨基酸位点突变的GlnA酶活,发现67和133位的氨基酸突变后酶活丢失,是GlnA关键酶活位点。2. GlnR和GlnA对TCA循环酶调控的研究利用实时荧光定量PCR检测了ΔGlnR、AGlnA突变株和WT野生菌株TCA循环中乌头酸酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶基因的表达情况。结果显示：乌头酸酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶在ΔGlnR、AGlnA表达都比WT低。而PCR扩增该操纵子的启动子,并将与GlnR结合的DNA进行了定点突变,通过电泳迁移率实验发现GlnR能够与该启动子的保守区域结合,且结合不依赖GlnA的互作。3.猪链球菌2型乌头酸酶基因突变株AAcnA的构建PCR分别扩增了乌头酸酶基因的上游片段、下游片段和红霉素抗性基因,按上游片段、红霉素抗性基因、下游片段的顺序共同连接到温敏型自杀性质粒pSET4s上,得到重组质粒pSET4s-AcnA。将重组质粒pSET4s-AcnA电转化到SC19感受态细胞中,通过抗性和温度筛选到对壮观霉素敏感而对红霉素不敏感的菌落,再用PCR、RT-PCR和测序确认突变株ΔAcnA构建成功。4.突变株ΔAcnA的生物学特性研究对ΔAcnA突变株和WT进行一系列生物学特性分析(遗传稳定性、生长曲线、形态结构、溶血活性、细胞感染实验和小鼠半数致死量)。结果显示ΔAcnA在对数生长期后期生长速度有所减慢,对Hep-2细胞的粘附和侵入能力有所上升,其它特性与野生菌株相比没有显著差异,表明乌头酸酶对猪链球菌2型的毒力没有影响。这些结果说明GlnA和GlnR对猪链球菌2型毒力的影响并不是通过调控TCA循环来发挥作用。