核糖核酸酶H（RNase H）能特异性地水解DNA/RNA杂交链中的RNA链释放出DNA链,在DNA复制、修复及转录等重要细胞过程中发挥着重要作用。所以开发出高灵敏度检测RNase H活性的方法十分重要。本文构建了两种光学DNA纳米传感器,并利用其在信号识别、信号转化和信号放大作用过程中的多种优势实现了对RNase H高灵敏度检测。首先借助DNAzyme驱动的DNA walker组装成一种荧光纳米探针,并将其用于检测RNase H,实现了对目标物的高灵敏度检测,操作过程简单,且表现出良好的选择性。接着利用DNA链置换反应并利用表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering,SERS）具有无损、灵敏度高、检测速度快等优点,结合磁珠易分离等优势进一步实现了对RNase H的比色和SERS双模式多信号快速检测。该工作对之后抗艾滋病药物的筛选以及生物药物的研究具有借鉴意义。主要研究内容及取得成果如下:1.DNAzyme驱动的DNA walker用于核糖核酸酶H的灵敏检测提出了一种在纳米颗粒表面并以DNAzyme驱动的信号放大策略用来检测RNase H的活性,检测范围为0 U/m L-5 U/m L,检测限低至0.0085 U/m L。首先在金纳米颗粒的表面修饰了Mn2+特异性DNAzyme的预封闭酶链和底物链,形成了DNA walker探针。其中底物链一端修饰有FAM荧光基团,当RNase H不存在的时候,由于金纳米颗粒具有良好的荧光猝灭效果,从而使得体系的荧光很微弱。在存在RNase H的情况下,DNA/RNA杂合复合物水解以释放单链DNA,该单链DNA能够与预封闭酶链上的封闭链杂交从而激活酶链。随着Mn2+的加入,被激活的酶链从底物链上的RNA碱基处进行切割,释放出的FAM由于离开Au NPs而使其荧光信号恢复。最终,修饰在Au NPs表面的酶链像机器一样在Au NPs上移动不断切割底物链释放荧光基团,起到了信号放大的作用,从而间接检测RNase H的活性。本方法用实验证明了在细胞裂解液中具有良好的检测RNase H的性能,并且可以用于抑制剂的筛选。2.比色和SERS双模式磁分离DNA纳米传感器用于核糖核酸酶H的灵敏检测合成了具有SERS信号的拉曼探针Au@4-MBA@Ag NPs,并修饰上功能DNA链。同样地,磁珠在孵育上金颗粒之后,修饰上功能DNA链,使之成为捕获探针。当RNase H存在时对DNA/RNA中RNA水解之后释放出DNA单链,一旦释放出的DNA单链与拉曼探针上的S2-DNA互补配对之后,SERS探针就不会与Fe3O4@Au NPs上的S1-DNA结合,从而不会被捕获。相反地,SERS探针就会被捕获,从而形成了Fe3O4@Au NPs-Au@4-MBA@Ag NPs的卫星结构,在磁力吸附之后,通过测定上清的SERS信号从而可以对RNase H进行定性和定量分析。同时,由于SERS探针本身具有颜色以及表面有G-quadruplex,加入Hemin孵育之后,再加入TMB显色剂和H2O2溶液便也可以对反应结果进行肉眼观测。本实验解决了前一个工作信号输出单一,检测时间长等缺点,具有操作简单的优势,检测范围是0 U/m L-2.5 U/m L,其检测限低至0.0018 U/m L。