【摘 要】
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油菜是我国也是西藏最主要的油料作物,随着西藏油菜种植面积不断扩大,土传植物病害日益增多,其中油菜菌核病尤为严重。本研究从林周县境内油菜病叶组织上分离出一株核盘菌LZ2,并从西藏7个县境内84份土壤样品中筛选出对其有拮抗作用的12株微生物,进而选取拮抗效果最好的多粘类芽孢杆菌JL4进行基因组学和代谢组学分析,探究其拮抗及促进植物生长的活性成分,为进一步该菌株的开发利用奠定理论基础,结果如下:1)从林
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油菜是我国也是西藏最主要的油料作物,随着西藏油菜种植面积不断扩大,土传植物病害日益增多,其中油菜菌核病尤为严重。本研究从林周县境内油菜病叶组织上分离出一株核盘菌LZ2,并从西藏7个县境内84份土壤样品中筛选出对其有拮抗作用的12株微生物,进而选取拮抗效果最好的多粘类芽孢杆菌JL4进行基因组学和代谢组学分析,探究其拮抗及促进植物生长的活性成分,为进一步该菌株的开发利用奠定理论基础,结果如下:1)从林周县境内采集的油菜病叶组织上分离出一株病原菌,命名为LZ2。菌丝呈白色且有黑色不规则菌核,菌核能够萌发出菌柄,菌柄末端长出杯盘状子囊盘。经形态学观察与分子生物学鉴定结果表明,该菌株LZ2为核盘菌。通过油菜侵染试验表明:该菌株能够侵染健康油菜叶片。2)通过平板对峙试验,从西藏7个县境内的84份土壤样品中分离筛选出12株对核盘菌LZ2有明显效果的拮抗微生物。其中,芽孢杆菌属7株,类芽孢杆菌属2株,白僵菌属2株,溶杆菌属1株。通过拮抗试验表明,多粘类芽孢杆菌JL4和辣椒溶杆菌NLM4对核盘菌LZ2的拮抗效果最显著,抑菌率均在25%以上。3)通过最适培养试验显示,多粘类芽孢杆菌JL4最适培养基为PDB,其生长曲线达到K值的时间为96h(最适培养时间);而辣椒溶杆菌NLM4的最适培养基为LB,其生长曲线达到K值的时间为48h(最适培养时间),最适培养初始p H为8。在25℃恒温培养条件下,菌株JL4的适应期为12h-36h,生长期为36h-60h,稳定期为60h-96h,96h后进入衰亡期;在25℃恒温培养箱培养下,菌株NLM4的适应期在12h以内,生长期为12h-24h,稳定期为24h-48h,48h后进入衰亡期。4)通过发酵上清液抑菌试验表明,菌株JL4的毒力回归方程为y=1.091+0.416x(r=0.983),菌株NLM4的毒力回归方程为y=1.287+0.436x(r=0.974),比较两者的斜率表明,菌株NLM4发酵上清液的抑菌效果略优于菌株JL4。但是平板对峙试验验证表明,菌株JL4的抑菌活性更显著,故选择菌株JL4进行基因组学和代谢组学分析。5)菌株JL4全基因组测序结果经质量剪切,得到高质量的clean data reads总数为7103636,碱基数量为106.4Mbp。通过GO数据库富集分析表明,菌株JL4有105个基因富集在抗生素合成相关的功能上,推测其参与多种抗生素合成;通过KEGG数据库富集分析显示,多粘类芽孢杆菌JL4有多条抗生素基因富集通路,涉及多种抗生素合成,其中链霉素、万古霉素以及多肽类抗生素基因富集较多,可能对菌株JL4的拮抗作用有重要贡献。此外,多粘类芽孢杆菌JL4有多条基因富集通路与促进植物生长有关;基于CARD数据库分析显示,菌株JL4的基因组测序信息共注释了125个耐药基因,其中有13个质粒相关基因,涉及到多种抗生素,包括报道较多的抗真菌活性成分粘菌素和杆菌肽。6)通过代谢组学分析表明,多粘类芽孢杆菌JL4检测出2843种代谢物。一级质谱代谢物分析发现JL4的代谢产物中包含多种抗生素和抗菌化合物,其中有72种抗生素代谢物,分为β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、蒽环类、多烯大环类、香豆素类、安莎类、离子载体类、多肽类、林可酰胺类等12类抗生素,占总的代谢物种类的2.53%。其它具有拮抗活性的代谢物有19种,可分为喹诺酮类、磺胺类、呋喃类、噁唑烷酮类、硝基咪唑类等5类抗菌代谢物,占总的代谢物种类的0.6%。基于对JL4代谢物总和数据标准化分析表明,利福霉素B相对含量较高,推测其对菌株JL4的拮抗作用贡献较大。二级质谱代谢物中,抗生素仅检测出甲硝唑,其含量高于其他抗生素和抗菌代谢物,推测其在多粘类芽孢杆菌JL4的拮抗效应中发挥重要作用。7)基于一级质谱代谢物KEGG通路富集分析结果显示,多粘类芽孢杆菌JL4代谢物中有多种抗生素合成。其中,据报道新生霉素、链霉素、利福霉素SV、利福霉素B、土霉素、四环素、金霉素以及多肽类等抗生素对真菌具有抑菌作用。此外,多粘类芽孢杆菌JL4代谢产物中还包含植物促生性的生长激素及含氮代谢物;而且菌株JL4的代谢产物中含有Fe3+载体物质,可通过与其他病原性真菌竞争铁元素而抑制植物病原菌生长。基于二级质谱代谢路通路分析,也证明菌株JL4能够产生一些抗生性及植物促生性代谢产物。
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