研究目的:支气管哮喘（哮喘）是一种慢性炎症性疾病,具有气道高反应性和气道重塑的特征。重症哮喘是临床上一种重要的疾病。重症哮喘大约占所有哮喘患者的10%,但是却要花费医疗费用的60%。目前,糖皮质激素作为治疗支气管哮喘的一线用药而广泛地应用于临床治疗。但是,对重症哮喘患者即使应用高剂量吸入性糖皮质激素联合其他控制药物,甚至于应用全身性糖皮质激素治疗仍然不易控制哮喘的症状。肥胖就是重症哮喘形成的重要因素之一。在美国对重症哮喘TENOR研究中发现,大约有31%儿童和57%成年人的重症哮喘患者存在肥胖症,远高于一般人群中儿童肥胖率20%和成人肥胖率35%。在临床研究中发现,肥胖哮喘患者与正常体重哮喘患者相比较,两者应用糖皮质激素治疗的效果的确存在差异,从而增加哮喘恶化、复发的风险,以及药物副作用的产生。肥胖是一个慢性的、全身性的炎症过程。肥胖产生的前炎症细胞因子（如:IL-1,IL-6,TNF-α）已经被证实不仅可以促进补偿性高胰岛素血症的形成,而且也促进支气管哮喘的发生和进展。研究发现,肥胖者的脂质产生的前炎症因子随着血液循环到达肺部,从而促进支气管哮喘的发生和进展,这点可能是肥胖这种类型哮喘患者单独应用吸入性糖皮质激素治疗效果不佳的原因之一。Fontes等对啮齿动物模型的研究发现,长期暴露于高水平的脂质能够增加β-细胞的数量,诱导高胰岛素血症的形成。根据文献报道,高胰岛素血症能够通过多种途径引发支气管哮喘的发生。例如:高胰岛素血症能够促进副交感神经细胞分泌乙酰胆碱;可以减少内源性支气管扩张剂一氧化氮的生物利用度;可以促进气道平滑肌细胞增生,从而增加气道高反应性,引发支气管哮喘的发生。然而,由于肥胖引发的高胰岛素血症是否参与支气管哮喘糖皮质激素不敏感的形成,尚无报道,需要进一步研究。糖皮质激素受体（GR）在糖皮质激素发挥抗炎作用中起到重要作用。糖皮质激素进入细胞浆后与糖皮质激素受体C端结合活化后,进入细胞核中,与糖皮质激素反应元件（GRE）相结合,促进/抑制特定的m RNA转录,指导蛋白质合成,发挥生物学效应。研究显示,肥胖哮喘和重症哮喘激素抵抗的原因之一是糖皮质激素受体表达缺陷和核转移的受损。另外,在对重症哮喘患者的外周血单个核细胞（PBMC）和气道平滑肌细胞（ASMC）的研究发现,重症哮喘患者的糖皮质激素受体表达和入核转移减少,然而应用p38MAPK抑制剂后可以恢复糖皮质激素的敏感性。而且,糖皮质激素受体和NF-κB之间存在相互拮抗作用。在重症哮喘患者中,NF-κB表达是增加的,这阻止GR和GRE的结合,影响糖皮质激素受体的转录活性,从而形成糖皮质激素抵抗。因此,我们推测高胰岛素血症可能通过p38MAPK和NF-κB信号通路干预糖皮质激素的抗炎作用,从而参与肥胖哮喘糖皮质激素抵抗的形成。细胞因子也与糖皮质激素抵抗有着密切的关系。Saba等在对肥胖哮喘患者的研究发现,IL-17可以导致GRα/GRβ比值的失调,从而形成对糖皮质激素反应性下降。IL-1参与以气道中性粒细胞增多为特征的哮喘形成糖皮质激素抵抗。研究发现,IL-1β可以降低糖皮质激素受体的表达、入核转移,以及影响转录因子的表达。而且,高水平胰岛素可以增加IL-1等炎症因子的表达,那么我们推测IL-1是否也参与高胰岛素血症形成糖皮质激素抵抗的过程。基于以上研究,本实验欲探讨高胰岛素血症与肥胖哮喘大鼠模型糖皮质激素治疗不敏感的关系,以及初步探讨在THP-1细胞中高水平的胰岛素减弱糖皮质激素抗炎作用的机制,为肥胖哮喘的治疗策略提供实验依据。研究方法:一、高脂饮食喂养的肥胖哮喘大鼠对糖皮质激素治疗抵抗的表现特征1、肥胖哮喘大鼠模型的建立,30只wistar大鼠随机分组:（1）对照组（2）哮喘组（3）哮喘激素治疗组（4）肥胖哮喘组（5）肥胖哮喘激素治疗组。对照组:普通饲料喂养。用PBS代替OVA对大鼠致敏和激发。哮喘组:普通饲料喂养。在实验进行的第1,8,15天对大鼠腹腔注射100毫克卵蛋白和100毫克氢氧化铝凝胶联合致敏,从第22天开始雾化吸入2%OVA,每天30分钟,隔日一次,共雾化激发8周。哮喘激素治疗组:普通饲料喂养。OVA致敏和激发过程同哮喘组。在雾化吸入OVA之前1小时,腹腔注射地塞米松（2mg/kg）。肥胖哮喘组:高脂饲料喂养。OVA致敏和激发过程同哮喘组。肥胖哮喘激素治疗组:高脂饲料喂养。OVA致敏和激发以及地塞米松治疗过程同哮喘激素治疗组。肥胖标准:体重大于对照组平均值的20%。2、利用高胰岛素血症-正葡萄糖钳夹实验评价大鼠胰岛素的敏感性。3、利用无创性肺功能仪检测大鼠的气道反应性。4、收集大鼠血液标本,用于检测GRα的核表达;以及GR、INS表达的检测。5、收集大鼠肺泡灌洗液,用于细胞的计数和分类;以及细胞因子表达的检测。6、收集大鼠的肺组织,用于HE和Masson染色;以及α-SMA的蛋白表达检测。二、高水平胰岛素在THP-1细胞中对GR表达的影响1、在THP-1细胞中,给予不同浓度胰岛素（0,20,200,200μIU/ml）处理24小后,利用western blot和q PCR方法检测GRα和GRβ的表达,计算GRα/GRβ比值。2、在THP-1细胞中,预先加入胰岛素200μIU/ml孵育24小时,再分别给予IL-1ra、SB203580和PDTC,利用western blot和q PCR方法检测各组GRα的表达。3、在THP-1细胞中,预先加入胰岛素200μIU/ml孵育24小时,再分别给予IL-1ra、SB203580和PDTC,利用western blot方法检测各组p-p38MAPK、p38MAPK和NF-κBp65的表达。三、高水平胰岛素在THP-1细胞中对GR和NF-κBp65核转移的影响。1、在THP-1细胞中,分别给予地塞米松,以及不同浓度胰岛素（20,200,200μIU/ml）处理后,利用免疫荧光方法观察GR在细胞核中的表达。2、在THP-1细胞中,分别给予胰岛素、地塞米松、胰岛素+地塞米松、胰岛素+地塞米松+SB203580处理后,利用western blot方法检测GR在细胞核和细胞浆中的表达。3、在THP-1细胞中,分别给予胰岛素、TNF-α、TNF-α+地塞米松、TNF-α+地塞米松+胰岛素处理后,利用western blot方法检测NF-κBp65在细胞和细胞核中的表达。4、在THP-1细胞中,分别给予TNF-α、TNF-α+地塞米松、TNF-α+地塞米松+胰岛素、TNF-α+地塞米松+胰岛素+SB203580、TNF-α+地塞米松+胰岛素+PDTC、TNF-α+地塞米松+胰岛素+IL-1ra处理后,利用ELISA方法检测IL-8的表达水平。研究结果:一、高胰岛素血症与肥胖哮喘大鼠的糖皮质激素抵抗存在相关性。1、肥胖哮喘大鼠的胰岛素水平高于哮喘组,提示高脂饲料喂养的肥胖哮喘组的大鼠存在高胰岛素血症。哮喘组的GIR60-120高于肥胖哮喘组,提示哮喘组大鼠的胰岛素敏感性高于肥胖哮喘组,肥胖哮喘组大鼠存在胰岛素抵抗。2、经过乙酰胆碱激发后,哮喘组和肥胖哮喘组的Penh值曲线与对照组比较左移。给予地塞米松治疗后,哮喘激素治疗组和肥胖哮喘激素治疗组的Penh值曲线右移,但是肥胖哮喘激素治疗组的Penh值曲线右移的程度小于哮喘激素治疗组。提示肥胖减弱了地塞米松降低哮喘大鼠气道反应性的效果。3、哮喘组和肥胖哮喘组大鼠的BALF中,细胞总数、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数目均高于对照组。经过地塞米松治疗后,哮喘激素治疗组的细胞总数、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数目比较哮喘组均降低。肥胖哮喘激素治疗组的细胞总数、嗜酸性粒细胞数目比较肥胖哮喘组均降低,中性粒细胞数目无显著性差异,而且细胞数目均高于哮喘激素治疗组。病理结果中发现,哮喘组和肥胖哮喘组的支气管周围可见炎性细胞浸润、气道上皮损伤增多;经过地塞米松治疗后,两组的炎性细胞浸润和气道上皮损伤均得到缓解,但是肥胖哮喘激素治疗组的病理表现仍多于哮喘激素治疗组。4、哮喘组和肥胖哮喘组大鼠的BALF中,IL-1β、IL-4、IL-5的水平均高于对照组。经过地塞米松治疗后,两组的细胞因子水平均有下降,但是肥胖哮喘激素治疗组的细胞因子水平仍高于哮喘激素治疗组。5、哮喘组和肥胖哮喘组大鼠肺组织中的胶原沉积高于对照组。经过地塞米松治疗后,哮喘激素治疗组的胶原沉积比较哮喘组有减少;然而肥胖哮喘激素治疗组的胶原沉积与肥胖哮喘组相比无显著差异,而且仍多于哮喘激素治疗组。6、哮喘组和肥胖哮喘组大鼠肺组织中的α-SMA蛋白表达水平高于对照组。经过地塞米松治疗后,哮喘激素治疗组的α-SMA蛋白表达水平比较哮喘组有减少;然而肥胖哮喘激素治疗组的α-SMA蛋白表达水平与肥胖哮喘组相比无显著差异,而且仍多于哮喘激素治疗组。7、哮喘组和肥胖哮喘组大鼠的血清中,IL-1β的水平均高于对照组。经过地塞米松治疗后,两组的IL-1β的水平均有下降,但是肥胖哮喘激素治疗组的IL-1β的水平水平仍高于哮喘激素治疗组。8、肥胖哮喘组大鼠血清中GRα表达和GRα/GRβ比值低于哮喘组,并且GRα表达与胰岛素水平存在负相关性。9、未经过地塞米松治疗时,对照组、哮喘组和肥胖哮喘组的PBMC中的GRα核表达无明显差异,GRα主要存在于细胞浆中。当地塞米松干预后,三组的核内GRα荧光强度都有增加,但是肥胖哮喘组的GRα核内表达低于其他两组。GRα在细胞核中的相对荧光强度与胰岛素水平存在负性相关。二、在THP-1细胞中,高水平胰岛素降低GR表达。1、在THP-1细胞中,随着胰岛素浓度的增加,GRα和GRβ的蛋白以及m RNA的表达有下降。与空白组相比较,GRα/GRβ比值无明显变化。2、在THP-1细胞中,高水平的胰岛素降低GRα的蛋白以及m RNA的表达。当分别加入IL-1ra、SB203580和PDTC后,与胰岛素组比较GRα的蛋白以及m RNA的表达有增加。3、与对照组相比,高水平胰岛素增加p-p38MAPK/p38MAPK的比值。当加入IL-1ra和SB203580后,与INS组相比较p-p38MAPK/p38MAPK的比值降低;当加入PDTC后p-p38MAPK/p38MAPK的比值没有明显变化。4、与对照组相比,高水平胰岛素增加NF-κBp65的表达。当加入IL-1ra、SB203580和PDTC后,与INS组相比较NF-κBp65的表达降低。三、在THP-1细胞中,高水平的胰岛素降低GR核表达,增加NF-κBp65的核表达。1、在THP-1细胞核中,免疫荧光结果显示,未处理组GR在细胞浆和细胞核中有表达,以细胞浆为主。当加入地塞米松后,GR核中表达明显增多;但是当预先有胰岛素加入时,GR核中表达降低。2、在THP-1细胞核中,westernblot结果同样证实地塞米松能够增加GR的核中表达,而高水平的胰岛素减少地塞米松诱导的GR核转移。但是,在细胞浆中,未发现对应的GR在细胞浆的滞留。当加入SB203580后,GR在细胞浆和细胞核中均有增加。3、在THP-1细胞中,高水平的胰岛素增加NF-κBp65的表达。当加入TNF-α刺激后,NF-κBp65的表达显著增加;地塞米松能够减少TNF-α诱导NF-κBp65的表达增加。但是,当预先加入高水平胰岛素处理后,NF-κBp65的表达比较TNF-α+DEX组有增加。4、在THP-1细胞核中,高水平的胰岛素增加NF-κBp65的表达。当加入TNF-α刺激后,NF-κBp65的表达显著增加;地塞米松能够减少TNF-α诱导NF-κBp65的表达增加。但是,当预先加入高水平胰岛素处理后,NF-κBp65的表达比较TNF-α+DEX组有增加。5、在THP-1细胞中,TNF-α刺激可以明显增加IL-8的水平,当加入地塞米松时IL-8的水平明显降低。但是,当预先加入高水平胰岛素处理后,IL-8的水平上升。再加入抑制剂IL-1ra、SB203580或PDTC时,IL-8的水平有降低。研究结论:1、高脂饮食诱导肥胖减弱了地塞米松对哮喘大鼠气道炎症、气道反应性和气道重塑的抑制作用。2、高脂饮食诱导肥胖的哮喘大鼠存在高胰岛素血症,并且高胰岛素血症与糖皮质激素治疗不敏感有相关性。3、在THP-1细胞中,高水平胰岛素能够减少GRα表达,减少GR入核表达,增加NF-κBp65入核表达,从而影响糖皮质激素发挥抗炎作用。4、IL-1β/p38MAPK信号通路和NF-κB信号通路参与高水平胰岛素对糖皮质激素抵抗的形成过程。