拟南芥GGB基因抗旱分子机制的研究

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干旱是影响植物正常生长发育的一种逆境因子,可造成农作物的严重减产,甚至是死亡,因此提高植物自身抗旱性对促进农业发展意义重大。植物ROP(Rho-related GTPases from plant)蛋白,又被称RAC,是高等植物体内广泛存在的一类参与信号转导的G蛋白,在植物生长发育、气孔调控等生理生化过程中具有非常关键的调控作用,被称为植物信号分子开关。如ROP2和ROP6都参与了对气孔的调控。拟南芥中参与异戊二烯化修饰的I型香叶酰基转移酶由α亚基PLP和β亚基GGB组成。研究表明参与蛋白异戊二烯化修饰的GGB蛋白在ABA介导的调控抗旱方面作用显著,但是GGB基因如何参与调控抗旱的分子机制并不明确。研究表明某些ROPs可以被异戊二烯化修饰,但ROP2和ROP6或更多的其他ROPs蛋白是否是GGB异戊二烯化修饰的靶蛋白,两者能否互作共同参与对抗旱的调控,目前并不清楚。因此本论文通过对拟南芥GGB与ROPs蛋白之间的互作进行研究,初步探究GGB调控气孔关闭的分子机制,为作物抗旱育种奠定理论基础。取得的主要研究结果如下:(1)克隆了拟南芥的ROP2、ROP3、ROP5、ROP6基因,并连接至pGBKT7载体上,克隆GGB基因,并连接至pGADT7酵母双杂交载体上、PLP连接至pBridge酵母三杂交载体上。酵母双杂交结果显示GGB不能与ROP2、ROP3、ROP5、ROP6在酵母体内结合,三杂交结果表明在PLP亚基的存在下,GGB依然不能与ROP2、ROP3、ROP5、ROP6结合。最后构建了GGB与上述ROPs基因的双分子荧光互补表达载体,实验结果表明ROP2、ROP3、ROP5、ROP6与GGB之间在烟草体内存在相互作用。(2)构建了35S-GFP-ROP6-P1 300载体,将构建的载体与含细胞膜定位marker基因m55的农杆菌共转化本氏烟草叶片,最终结果显示ROP6定位在细胞膜上。将35S-GFP-ROP6-P1 300转化野生型拟南芥和拟南芥ggb突变体,结果表明ROP6在野生型拟南芥和ggb突变体中亚细胞定位并没有明显变化。(3)利用“双引物”法和RT-PCR成功鉴定了 rop6 T-DNA插入纯合突变体,用该突变体进行抗旱相关指标检测和干旱处理,结果表明:rop6 T-DNA插入突变体在叶片失水率和复水后存活率上与野生型并无明显差异,推测在抗旱的过程中还有其他ROPs基因参与,ROPs参与拟南芥抗旱具有冗余性。(4)为了进一步鉴定参与抗旱过程中的其他ROPs基因,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,根据ROP3、ROP5、ROP3/ROP5、ROP6CDS及基因组序列每个基因各设计两个靶位点,构建带有AtROPs靶序列AtU6::SgRNA-Cas9-P1300基因编辑载体,利用浸花法稳定转化野生型拟南芥,筛选获得了 70株的转基因阳性苗,基因编辑突变序列正在检测中。这为挖掘更多抗旱ROPs基因提供了材料基础。
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