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沉默调节蛋白Sirtuin是一组重要的蛋白质,它们在衰老、胁迫和代谢的过程中起着十分重要的调节功能。哺乳动物中共有7个同源蛋白,而在拟南芥中只有二个,分别为AtSIRT1(At5g09230)和AtSIRT2(At5955760)。本文主要研究表达在线粒体中AtSIRT1的基因功能。
AtSIRT1具有多个转录本,可以产生4种成熟的mRNA,本文中分别命名为S1.3,51.4,S1.5,S1.7。半定量RT-PCR分析表明,它们在不同组织中表达行为有一定的差别。启动子分析表明AtSIRT1旺盛表达于分生组织,且受光照调节。利用Gateway重组克隆体系构建了N端绿色荧光蛋白的融合蛋白表达株系,发现除了S1.4定位于细胞核,其余均定位于线粒体。用FLAG蛋白标签过量表达这四种转录本,分别命名为S1.3-FLAG,S1.4-FLAG,S1.5-FLAG和S1.7-FLAC,本文重点研究S1.3-FLAG和S1.7-FLAG的功能。另外,本文还鉴定了AtSIRT1的两个T-DNA插入突变体株系131994C和N433426。
对S1.3-FLAG,S1.7-FLAG,131994C和N433426四个株系进行表型观察,发现S1.7-FLAG株系的种子萌发迟缓,萌发率低,幼苗个体偏小,在高糖培养基中,有停止生长、甚至致死的表型;而S1.3-FLAG,131994C和N433426株系的种子萌发速度快,幼苗个体大,在高糖培养基中生长旺盛。植物体内的葡萄糖含量测定表明,在正常B5和高糖培养基中,131994C和N433426的葡萄糖含量稍低于野生型;S1.3-FLAG在正常B5培养基中的葡萄糖含量与T-DNA突变体齐平,而在高糖培养基中却明显低于野生型和T-DNA突变体;S1.7-FLAG株系的葡萄糖含量在两种培养基上均明显低于野生型。
在测定谷氨酸脱氢酶(GDH)同工酶活性中发现,S1.7-FLAG株系无论是在B5还是高糖培养基中,其活性远远高于野生型;T-DNA突变体在高糖培养中GDH活性与野生型相同,而在B5培养基中则略弱于野生型;S1.3-FLAG的GDH活性无论在什么条件下,均弱于野生型。初步的机理探讨认为,S1.7-FLAG过量表达可以提高GDH酶活性,可能改变了进入TCA循环的碳骨架供应,进而出现致死现象。S1.3可以看做缺少活性的S1.7蛋白,所以它的效应与S1.7相反。