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恶性肿瘤是迄今严重危害人类健康的重要疾病之一,侵袭和转移是恶性肿瘤两个关键的生物学行为,也是影响肿瘤患者临床预后的主要因素,在相当长的时间内恶性肿瘤的侵袭和转移仍然是人类面临的亟待解决的重大基础和临床问题。肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤多阶段的复杂过程,受众多相关因素的共同影响。在这些相关因素中,各种蛋白酶在肿瘤的侵袭转移中发挥着重要的作用。以往人们对蛋白酶的研究主要侧重于其降解细胞外基质,从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移,近年的研究表明,蛋白酶还能通过激活各种信号传导途径、调控相应的基因表达而参与肿瘤发生发展的整个过程。蛋白酶对基因表达的调控主要是通过位于细胞膜表面的蛋白酶激活受体（protease-activated receptors, PARs）进行的。PARs是一类带7个跨膜区的自身带有配体的特殊的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）,其N端经特异性蛋白酶水解后成为自身配体而被活化,并通过与其偶联的G蛋白酶触发一系列信号传导,进而调控下游相应基因的表达。目前已明确的PARs有4种,其中PAR4 （protease-activated receptor 4）是近年来发现的一个亚型,是一个低亲和力的凝血酶受体。研究表明,PAR4在乳腺癌、肝癌、肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、星形细胞瘤等多种恶性肿瘤细胞中表达升高,根据这些情况,可以推测PAR4表达水平与这些恶性肿瘤的生物学行为相关,但PAR4在不同肿瘤细胞中表达升高的原因及其与肿瘤细胞的生长、侵袭转移等恶性表型的关系,目前的研究均未涉及。本课题以PAR4作为研究对象,以人肠癌细胞SW620为模型,采用人工microRNA技术对PAR4进行表达抑制,研究抑制PAR4表达对肠癌细胞SW620生长、移及耐药等恶性表型的影响。具体内容如下：1.靶向抑制PAR4表达的人工microRNA表达载体的构建：1.1根据NCBI的GenBank数据库获得人PAR4的mRNA序列的资料（登录号NM003950）,利用网络资源（http://cancan.cshl.edu/cgi-bin/Codex/Codex.cgi）,选择合适的人工microRNA序列,通过两次PCR扩增获得142 bp的人工microRNA前体片段,克隆至pMD19-T载体上,用BamH I和BglⅡ双酶切鉴定,并经DNA测序证实。1.2将经测序证实正确的人工microRNA前体序列进行串联连接,得到8个串联连接的人工microRNA前体序列后,以BamH I和BglⅡ双酶切,亚克隆于经去磷酸化pcDNA3.1（+）的BamH I位点,用BamH I和PvuⅠ酶酶切鉴定转化子质粒,将正向插入片段的表达载体命名为pcDNA3.1（+）-8×PAR4-ami。2.PAR4表达抑制对SW620细胞生长运动能力的影响2.1细胞转染：利用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1（+）-8×PAR4-ami表达载体转染人肠癌细胞SW620,G418筛选抗性细胞克隆,Western Blot检测PAR4表达,获得稳定转染人工microRNA表达载体的SW620细胞。同样转染pcDNA3.1（+）空载体至SW620细胞并筛选G418抗性细胞克隆,提取基因组DNA,以PCR法鉴定稳定转染细胞。2.2 MTT法检测PAR4表达抑制对SW620细胞在体外生长能力的影响：将人工microRNA表达载体稳定转染组（SW620/pcDNA3.1（+）-8×PAR4-ami）空载体转染对照组（SW620/pcDNA3.1（+））和未转染对照组（SW620）分别接种于96孔板,培养0-5天,加MTT孵育,用DMSO溶解结晶,在570 nm处读取吸光度值,绘制生长曲线。结果显示,转染人工microRNA表达载体的细胞与两个对照组相比,生长呈明显减慢的趋势,均有显著差异（P<0.01）2.3软琼脂集落形成法检测PAR4表达抑制对SW620细胞体外生长能力的影响：将上述三组细胞分别在用RPMI1640配制的033%软琼脂中培养14天后,计数各组细胞形成的多于50个细胞的克隆数,结果显示,转染人工microRNA表达体的SW620细胞的软琼脂克隆形成数量与两个对照组相比均有显著差异（P<0.01）。2.4划痕试验检测PAR4表达抑制对SW620细胞体外迁移能力的影响：将处于指数生长期的上述三组细胞分别接种于六孔板,加丝裂霉素C处理24h后换正常的含10%小牛血清的RPMI1640培养液,用10μl加样枪头在六孔板中划痕,分别培养0、2、4、6天,在倒置显微镜下观察并记录划痕边缘细胞向空白区扩散运动情况。结果显示在第O、2天各组细胞无明显差异,第4、6天人工microRNA表达载体稳定转染细胞向划痕区扩散减慢,与两个对照组相比出现较为明显的差异。2.5 Transwell法检测PAR4表达抑制对SW620细胞穿膜运动能力的影响：将上述三组细胞分别悬浮于无血清培养液中接种到置于24孔板的Transwell小室中,外加正常含血清培养液培养3天后结晶紫染色,在400倍显微镜下计数穿膜细胞数。结果显示,转染pcDNA3.1（+）-8×PAR4-ami的细胞组迁移能力与两个对照组细胞均有显著差异（P<0.01）2.6流式细胞术检测PAR4表达抑制对SW620细胞周期的影响：将上述三组细胞接种于六孔板培养,收集细胞,PBS洗涤后,用70%乙醇溶液4℃固定过夜,以PBS洗涤细胞后，碘化丙啶染色,流式细胞仪测定细胞周期分布。结果显示,PAR4表达抑制可以引起SW620细胞G2/M期减少。3.IC50法测定PAR4表达抑制对SW620细胞药物敏感性的影响：取处于对数生长期的上述三组细胞,接种96孔板中,加入不同浓度的5-氟尿嘧啶和顺铂,培养3天后用MTT法进行检测,计算IC50。结果显示,抑制PAR4的表达可以明显提高SW620细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂的耐药性（P<0.01）。通过本课题的研究,得到以下创新性结论：1、本课题设计的针对PAR4的人工microRNA可以有效地抑制SW620细胞内的PAR4的表达；2、PAR4表达抑制对SW620细胞增殖、迁移／运动能力具有明显的抑制作用,可以引起SW620细胞G2/M期减少,并且能提高SW620细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂的耐药性。