背景:慢性肾衰竭(CRF)的患病率呈逐年上升的趋势,具有患病率高、知晓率低、医疗费用高、预后不佳、死亡率高等特点。现代医学对CRF无较理想的治疗方法、以达到延缓肾功能进展的目的。最新研究表明Klotho蛋白作为抗衰老因子、肾脏保护性因子,具有延缓肾脏衰老作用,有望成为CRF的预测指标和治疗靶点。近年来中医药广泛应用于CRF患者,尤其是早、中期患者,以保护残存肾单位、改善症状、延缓开始肾脏替代治疗时间、提高生活质量、延长生命为原则,延缓肾功能进展,表现出良好优势及特色。肾宁Ⅱ号方作为姚源璋教授治疗CRF经验方,在前期临床观察研究中取得理想疗效。肾宁Ⅱ号方主要由以黄芪、制首乌、制大黄、川芎、水蛭、桃仁、泽兰等组成,具有补肾泻浊、活血化瘀作用,既往已对桃仁、泽兰、水蛭对肾脏的保护作用机制进行研究。但对于本方中补肾类中药黄芪、制首乌对肾脏保护作用机制尚未阐明,是否与肾脏保护性因子Klotho蛋白有关,还需进一步探索研究。目的:观察CRF大鼠模型及中药干预组模型肾功能、钙磷代谢的动态变化与Klotho蛋白表达之间的相关性以及各组肾脏病理改变;通过黄苗、制首乌、黄首合剂干预CRF大鼠模型,观察各组对肾组织中Klotho蛋白的影响,初探补肾类中药黄芪、制首乌的肾保护作用机制。方法:采用腺嘌呤灌胃的方法建立CRF大鼠模型。造模结束后眼眶取血测定尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血磷、血钙,收集24h尿液,记尿量,测定尿肌酐(Ucr)、尿磷、尿钙,测体重,根据结果筛选。成模组随机分组:黄芪高组(HG)、黄芪低组(HD)、首乌高组(SG)、首乌低组(SD)、黄首合剂高组(HSG)、黄首合剂低组(HSD)。各组药物干预组予以相应浓度的药物灌胃治疗,模型组和正常组予以相应等量的生理盐水灌胃。药物干预期间每周称取体重、观察记录一般情况变化。药物干预结束后再次测定血尿生化指标,蛋白质印迹法(Western Blot)检测肾皮质蛋白Klotho蛋白表达,光镜下观察经苏木素伊红染色(HE)的肾组织病理改变,免疫组化测Klotho蛋白在肾小管内的阳性染色表达。应用SPSS22.0软件进行统计学比较。结果:(1)体重变化:药物干预后,模型组体重无明显增长(P>0.05),而其他各药物干预组与正常组均体重增长明显(P<0.01)。(2)肾功能变化:正常组、模型组干预前后对比无明显统计学差别(P>0.05),各给药组血肌酐、尿素氮均有改善,且尿肌酐排泄增加,其中黄芪组(P<0.01)肾功能改善优于其他给药组。(3)内生肌酐清除率变化:黄芪高、低组、首乌高、低组、黄首合剂低组肾功能改善显著(P<0.01),黄首合剂高组肾功能改善不及其他给药组明显(P<0.05),正常组、模型组无统计学意义。(4)钙磷代谢变化:正常组、模型组无明显变化(P>0.05),各给药组均有不同程度调节钙磷代谢的作用(P<0.05)。其中黄芪高、低组、黄首合剂低组促进尿磷排泄、降低血磷作用显著;黄芪高、低组、首乌高组、黄首合剂高组促进尿钙排泄作用显著,黄芪高、低组、首乌高、低组血钙有显著下降趋势(P<0.01),黄首合剂疗效欠佳。(5)肾脏病理改变:各造模组均可见大小不等的黄褐色结晶沉积于肾小管、肾间质,少部分可见于肾小球内。模型组大鼠肾脏皮髓分界不清,且皮质明显变薄,肾小球硬化萎缩、球囊腔变大、囊壁增厚,毛细血管丛分叶状明显、血管袢开放不佳,偶见肾小球动脉血栓;肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落,管腔扩张,可见大量蛋白管型,肾间质纤维组织增生明显,伴大量炎症细胞浸润。黄芪高组肾小球结构轻微改变,未见明显球性硬化萎缩、分叶,少量肾小管上皮细胞变性坏死、管腔扩张,可见局灶肾间质纤维增生,伴少量散在炎症细胞浸润。黄芪低组肾小球系膜基质中度增生,毛细血管丛轻微分叶状,球囊腔增大;肾小管管腔扩张明显,伴少量上皮细胞空泡变性、坏死,病变较黄芪高组稍重。首乌高组肾小球硬化萎缩、囊腔扩大明显,毛细血管袢开放不良,小管坏死脱落明显,间质纤维化、炎症细胞浸润显著,但病变较模型组轻微。首乌低组肾小球中度病变,大量肾小管坏死脱落、肾间质纤维增生、炎细胞浸润,伴少量蛋白管型,但病变较首乌高组较减轻。黄首合剂高组肾小球局灶硬化,囊腔扩大,系膜基质增生及基底膜增厚,血管丛分叶状、开放不良,肾小管空泡变性、坏死、脱落、官腔增大,伴局灶间质纤维化、炎细胞浸润。黄首合剂低组肾小球球性硬化萎缩不显、血管袢开放良好,囊腔扩大、囊壁增厚,小管变性坏死、管腔变大,肾间质局灶纤维化、炎症细胞浸润,病变较黄首合剂高组较减轻。(6)免疫组化:各组肾组织均可检测到Klotho蛋白的表达,正常组最多,模型组最少,各给药组较模型组Klotho蛋白表达增加(P<0.05),其中黄芪高、低组、首乌低组、黄首合剂低组疗效更显著(P<0.01)。(7)Western Blot结果:各组肾组织均可检测到Klotho蛋白的表达,正常组Klotho蛋白表达量最高,模型组表达量最少。各给药组Klotho蛋白表达增加(p<0.05),其中黄芪高、低组、首乌高、低组、黄首合剂低组蛋白表达量的增加更为明显(P<0.01)。(8)Klotho蛋白与生化指标的相关性:随着大鼠肾脏Klotho蛋白表达的增加,Ccr、尿磷、尿钙逐渐增加,尿素氮、血磷下降明显,肾功能明显改善,表明Klotho蛋白与Ccr、尿磷、尿钙呈正相关关系,与血肌酐、尿素氮呈明显负相关的关系。但Klotho蛋白的增加未见血钙的明显下降。结论:补肾类中药黄芪、制首乌能够通过上调肾脏局部Klotho蛋白的表达,发挥肾保护作用,通过降低血肌酐、尿素氮、血磷,增加内生肌酐清除率及尿磷、尿钙的排泄,改善肾功能及相关症状,减轻肾组织病理结构损伤,延缓肾功能进展,其中黄芪高剂量组疗效最佳。