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脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,是诱导机体炎症损伤的主要因素。在现代畜牧业养殖中,为追求高产量的肉、奶制品,以取得更大的利润效益,对反刍动物饲喂高谷物比例的精料以满足动物自身高产性能需求。过量易发酵精料致使反刍动物瘤胃酸度降低,革兰氏阴性菌裂解死亡释放LPS,引发机体炎症反应。而肝脏是机体重要的免疫器官,被称为机体加工厂,参与机体的消化吸收、蛋白质合成、对有毒物质的解毒和免疫反应。过量LPS在肝脏内蓄积时,肝脏易受到LPS的攻击,使其结构发生变化,功能受到损伤,细胞凋亡程度加重。本试验通过三部分来研究高精料日粮对反刍动物肝脏细胞凋亡的影响及丁酸钠的调控作用。1.高精料日粮对奶牛肝脏细胞凋亡的影响本试验选用12头安装瘤胃瘘管和肝、门静脉血管插管的泌乳中期荷斯坦奶牛进行高精料日粮对反刍动物肝脏细胞凋亡的影响的研究。试验随机分成两组:高精料组(High concentrate diet,HC)(精粗比 6:4,n=6)和低精料组(Low concentrate diet,LC)(精粗比4:6,n=6)。饲喂后通过瘤胃瘘管采集0-12 h瘤胃液,并用pH计检测瘤胃pH值。采用生化分析方法检测外周血中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白含量以检测高精料饲喂条件下奶牛肝脏的损伤程度。通过肝脏血管插管采集门静脉、肝静脉血液检测肝脏中脂多糖(LPS)的含量。采用实时荧光定量PCR法检测肝脏中凋亡相关基因的表达,放射免疫法检测外周血中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度,分光光度计法测定肝脏细胞中Caspase-3、Caspase-8酶的活性,Westernblot法测定NF-κB的蛋白表达量。试验结果:20周后,高精料组瘤胃内pH低于5.6并每天持续3 h以上,显示奶牛发生亚急性瘤胃酸中毒。与低精料组相比,高精料组奶牛肝细胞受到一定程度损伤,门静脉LPS的浓度显著升高,肝功能也受到影响,肝脏中促凋亡基因表达上调,抗凋亡基因表达下调,外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度显著升高,NF-κB的蛋白表达量升高,Caspase-3和Caspase-8的酶活性都表达上调,且Caspase-3有显著性的差异。结果显示,长期饲喂高精料,使消化道中的LPS由门静脉进入肝脏,引起肝脏的炎性损伤,增加肝细胞的凋亡程度。2.高精料日粮奶山羊肝脏细胞凋亡的影响及丁酸钠调控作用长期饲喂高精料诱导反刍动物发生SARA,由瘤胃内革兰氏阴性菌裂解产生细菌内毒素(LPS)通过门静脉进入肝脏,对肝脏造成损伤并导致细胞凋亡。本试验选用18头泌乳中期的萨能奶山羊为研究对象,通过饲喂低精料、高精料和在高精料日粮中添加丁酸钠,研究高精料日粮对奶山羊肝脏损伤和细胞凋亡的影响及丁酸钠调控作用。将18头奶山羊随机分成3组:低精料组(LC),高精料组(HC),丁酸钠+高精料组(SHC)。在饲养20周后,通过安装的瘤胃瘘管采集0-10 h瘤胃液,并用pH计检测瘤胃pH值。通过生化分析法检测肝功能生化参数指标以确定奶山羊肝脏的损伤程度。通过肝脏血管插管采集门静脉、肝静脉血液检测肝脏中LPS的含量。采用放射免疫法检测外周血中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度,实时荧光定量PCR法检测肝脏中凋亡相关基因的表达。试验结果:饲养20周后,高精料组瘤胃pH低于5.8并持续4 h,说明奶山羊发生亚急性瘤胃酸中毒,而添加丁酸钠组瘤胃pH介于高精料和低精料组之间,减轻因高精料引起的pH持续降低。与低精料组和丁酸钠组相比,高精料组奶山羊肝脏酶的活性明显增强,蛋白表达量下调,肝脏功能受到一定程度损伤,门静脉、肝静脉中LPS的浓度显著升高,肝脏中促凋亡基因表达上调,抗凋亡基因表达下调,外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度显著升高。结果显示,长期饲喂高精料,使消化道中的LPS由门静脉进入肝脏,引起肝脏的炎性损伤,增加肝细胞的凋亡程度,而在高精料日粮中添加丁酸钠能缓解肝脏的功能损伤和细胞凋亡程度。3.高精料日粮对奶山羊肝脏细胞凋亡信号通路的探究及丁酸钠调控作用细胞凋亡是机体的正常细胞受到病理性或生理性刺激后所发生的自发性死亡程序,是由基因控制的及一系列酶参与的过程。细胞凋亡分线粒体、死亡受体途径。为研究高精料日粮及日粮中添加丁酸钠对反刍动物肝脏细胞凋亡的影响及凋亡过程中的主要信号通路,本试验选用18头萨能奶山羊为研究对象,随机分成三组:低精料组(LC)、高精料组(HC)、丁酸钠+高精料组(SHC)。采用Western方法测定TNF-α、NF-κB(p65,Phospho-p65)、细胞色素 C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 及激活型 Caspase-3在肝脏组织中的蛋白表达量,用分光光度计法测定肝脏组织中Caspase-3和Caspase-8的酶活性。试验结果显示:与LC组相比,HC组中的TNF-α、NF-κB(p65,Phospho-p65)、细胞色素C、Bax、Caspase-3及激活型Caspase-3蛋白在肝脏组织中的表达量及Caspase-3、-8的酶活性均显著性升高,而Bcl-2表达量显著下降;与HC组相比,SHC 组中的 TNF-α、NF-κB(p65,Phospho-p65)、细胞色素 C、Bax、Caspase-3及激活型Caspase-3表达量及Caspase-3、-8的酶活性都有所下调,Bcl-2表达上调。结果显示,在高精料引起反刍动物肝脏细胞凋亡及日粮中通过添加丁酸钠对凋亡调控的研究中,细胞凋亡的线粒体、死亡受体途径都有参与。