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研究背景：
泛素-蛋白酶体系统(UPS)是真核细胞内蛋白质降解的主要系统，涉及多种细胞生命过程的调控，包括细胞周期，细胞凋亡和蛋白质质量控制等，对维持细胞的正常生理功能具有非常重要的意义，同时也与疾病的发生发展密切相关，如肿瘤[1]。UPS降解蛋白质的过程主要包括三部分：首先需要被降解的蛋白被泛素标记；其次被标记的底物蛋白被蛋白酶体识别并降解；最后去泛素化酶移除底物蛋白上的泛素链[2]。在医学上，2-巯基吡啶氮氧化物(PT)高效、安全、具有杀菌活性，因其能和大多数金属形成稳定配合物，所以经常被用作配体合成金属配合物。我们实验室前期利用PT作为配体分别合成了多种化合物，如吡啶硫酮铜(CuPT)、吡啶硫酮铂(PtPT)和吡啶硫酮镍(NiPT)，表现出优良的抗肿瘤效应，证明PT可以稳定地和金属离子结合从而表现出明显抑制肿瘤生长的特点。一价金离子化合物-金诺芬(Auranofin，Aur)，它是一种人工合成的金离子配合物，在临床上安全有效地治疗类风湿关节炎，目前被美国FDA批准作为抗肿瘤药物进入临床Ⅱ期试验。我们课题组研究发现Aur可以通过抑制19S蛋白酶体相关去泛素化酶(DUBs)从而抑制肿瘤细胞生长，此部分结果已发表(2014，Oncotarget)[3]。我们设想以PT作为配体与金离子络合形成新的化合物，研究其是否具有明显抗肿瘤效应及机制。首先合成三价金离子配合物AuPT(Ⅲ)，发现AuPT(Ⅲ)既抑制DUB活性，同时也抑制20S蛋白酶体的活性。接着我们合成了一价金离子化合物AuPT(Ⅰ)，发现其可以明显抑制DUB活性，而在一定剂量范围内对20S蛋白酶体活性没有抑制作用。研究表明与20S蛋白酶体相比，DUB对蛋白的降解具有更好的选择性和特异性，成为抗肿瘤的新靶点[4]，但目前尚未有应用于临床治疗疾病的DUB抑制剂。本课题将进一步确证AuPT(Ⅰ)对DUB的抑制作用及其具体靶点，并全面研究AuPT(Ⅰ)是否具有明显的抗肿瘤效应及其与DUB抑制的关系，进一步探索AuPT(Ⅰ)能否作为DUB抑制剂开发成临床抗肿瘤药物。
研究目的：
1、明确AuPT(Ⅰ)的DUB抑制效应及其具体靶点；
2、明确AuPT(Ⅰ)抗肿瘤效应与DUB抑制作用的关系。
研究方法
1、细胞活力检测：MTS法检测AuPT(Ⅰ)对肿瘤细胞活力的影响。
3、细胞凋亡检测：流式细胞检测仪检测AnnexinV-FITC/PI染色的细胞凋亡情况，倒置荧光显微镜下动态观察AnnexinV-FITC/PI标记的细胞形态学变化情况。
4、相关蛋白的检测：WesternBlot法检测UPS相关蛋白及细胞凋亡相关蛋白的变化。
5、蛋白酶体相关蛋白酶活性检测：多功能荧光酶标仪检测20S蛋白降解酶及26S去泛素化酶的底物降解情况。
6、裸鼠肿瘤模型实验：A549、NCI-H1299细胞接种于SPF级裸鼠右侧腋窝皮下，AuPT(Ⅰ)每日腹腔注射，观察肿瘤变化及裸鼠活动情况。
7、免疫组化：检测裸鼠肿瘤组织中相关蛋白变化情况。
研究结果：
1、AuPT(Ⅰ)对肿瘤细胞的毒性
1)AuPT(Ⅰ)抑制肿瘤细胞活力
选用人胃腺癌细胞MGC-803、SGC-7901及人非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H1299为研究对象，不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用24、48、72h后，MTS法检测细胞活力，结果显示，AuPT(Ⅰ)明显抑制肿瘤细胞活力，且呈浓度和时间依赖性。
2)AuPT(Ⅰ)诱导肿瘤细胞凋亡
不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用人胃腺癌细胞MGC-803、SGC-7901、非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H129924h，AnnexinV-FITC/PI双染的阳性细胞明显增多，并伴有典型的细胞凋亡形态学变化；AnnexinV-FITC/PI流式检测结果也显示AuPT(Ⅰ)能够明显诱导肿瘤细胞凋亡。
3)AuPT(Ⅰ)引起肿瘤细胞内死亡相关蛋白的增加
不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用人胃腺癌细胞MGC-803、SGC-7901、非小细胞肺癌A549、NCI-H1299一定时间，免疫印迹结果显示随着浓度增高和时间增加，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9前体明显减少，活化带逐渐增多；PARP前体减少，切割带出现。
2、AuPT(Ⅰ)抑制蛋白酶体功能
不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用人胃腺癌细胞MGC-803、SGC-7901、非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H1299一定时间、稳定转染GFPu的HEK-293细胞6h。结果显示，AuPT(Ⅰ)可以浓度依赖性引起肿瘤细胞内总的泛素化蛋白、K48-链接的多聚泛素化蛋白及26S蛋白酶体特异性外源性蛋白GFPu浓度依赖性聚集增加。
3、AuPT(Ⅰ)抑制蛋白酶体功能的靶点位于DUBs
1)AuPT(Ⅰ)对20S蛋白酶体功能无明显影响
以不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用于细胞提取裂解液蛋白，加入相应的酶解底物，多功能酶标仪(350/438 nm)检测AMC释放的荧光强度。结果表明，AuPT(Ⅰ)对细胞内20S蛋白酶体的半胱天冬蛋白酶样(Caspase-like)、胰蛋白酶样(Trypsin-like)、糜蛋白酶样(Chymotrypsin-like)酶解活性无影响。
2)AuPT(Ⅰ)抑制26S蛋白酶体功能
以不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用于纯化的26S蛋白酶体和细胞提取裂解液蛋白，加入Ub-AMC，多功能酶标仪(350/438 nm)检测，观察DUB活性的动态变化。结果显示AuPT(Ⅰ)更明显的抑制26S蛋白酶体去泛素化酶的活性。
3)AuPT(Ⅰ)靶向作用于26S蛋白酶体相关去泛素化酶UCLH5和USP14
不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用于纯化的26S蛋白酶体，加入UbVS，Westernblot检测HA水平，结果显示，AuPT(Ⅰ)能竞争UbVS对UCLH5和USP14活性位点占据。
4、AuPT(Ⅰ)通过抑制蛋白酶体功能从而诱导细胞凋亡
用AuPT(Ⅰ)2μM分别处理A549、NCI-H1299细胞后，在指定时间收集细胞提取总蛋白，采用WesternBlot法检测Ub-Prs.、PARP的表达情况。结果显示AuPT(Ⅰ)在处理细胞6小时后出现泛素化蛋白和蛋白酶体底物的大量聚集，而指示细胞出现凋亡的PARP则在12小时后才出现切割带，这些结果说明AuPT(Ⅰ)诱导的细胞凋亡出现在蛋白酶体功能抑制之后。
5、AuPT(Ⅰ)可选择性诱导白血病细胞细胞凋亡并抑制其蛋白酶体功能
用不同浓度的AuPT(Ⅰ)处理7例白血病病人(Pt)和6例正常人外周血液的单个核细胞，用MTS法、流式细胞术检测和荧光显微镜拍照，结果显示AuPT(Ⅰ)可剂量依赖性地诱导白血病病人外周血单个核细胞的凋亡，对正常人外周血单个核细胞活力抑制的IC50值高于白血病病人，将近5倍。Westernblot结果显示经过AuPT(Ⅰ)处理的白血病病人外周血单个核细胞总的泛素化蛋白聚集明显增多。表明与正常人单个核细胞相比，AuPT(Ⅰ)更为明显的抑制白血病病人单个核细胞蛋白酶体功能并诱导产生更明显的细胞毒性作用。
6、AuPT(Ⅰ)可明显抑制裸鼠移植瘤(A549、NCI-H1299)的生长并诱导肿瘤组织中泛素化蛋白的表达
裸鼠肿瘤模型实验结果显示AuPT(Ⅰ)可显著抑制裸鼠移植瘤的生长。采用免疫组化方法检测肿瘤组织中Ub-Prs、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase8均增加，说明在体实验中AuPT(Ⅰ)抑制了肿瘤组织细胞蛋白酶体功能并诱导其凋亡。
研究结论：
1、AuPT(Ⅰ)主要通过抑制DUB活性从而引起蛋白酶体功能的抑制；
2、AuPT(Ⅰ)对DUB的抑制作用是其抗肿瘤效应的主要机制。
泛素-蛋白酶体系统(UPS)是真核细胞内蛋白质降解的主要系统，涉及多种细胞生命过程的调控，包括细胞周期，细胞凋亡和蛋白质质量控制等，对维持细胞的正常生理功能具有非常重要的意义，同时也与疾病的发生发展密切相关，如肿瘤[1]。UPS降解蛋白质的过程主要包括三部分：首先需要被降解的蛋白被泛素标记；其次被标记的底物蛋白被蛋白酶体识别并降解；最后去泛素化酶移除底物蛋白上的泛素链[2]。在医学上，2-巯基吡啶氮氧化物(PT)高效、安全、具有杀菌活性，因其能和大多数金属形成稳定配合物，所以经常被用作配体合成金属配合物。我们实验室前期利用PT作为配体分别合成了多种化合物，如吡啶硫酮铜(CuPT)、吡啶硫酮铂(PtPT)和吡啶硫酮镍(NiPT)，表现出优良的抗肿瘤效应，证明PT可以稳定地和金属离子结合从而表现出明显抑制肿瘤生长的特点。一价金离子化合物-金诺芬(Auranofin，Aur)，它是一种人工合成的金离子配合物，在临床上安全有效地治疗类风湿关节炎，目前被美国FDA批准作为抗肿瘤药物进入临床Ⅱ期试验。我们课题组研究发现Aur可以通过抑制19S蛋白酶体相关去泛素化酶(DUBs)从而抑制肿瘤细胞生长，此部分结果已发表(2014，Oncotarget)[3]。我们设想以PT作为配体与金离子络合形成新的化合物，研究其是否具有明显抗肿瘤效应及机制。首先合成三价金离子配合物AuPT(Ⅲ)，发现AuPT(Ⅲ)既抑制DUB活性，同时也抑制20S蛋白酶体的活性。接着我们合成了一价金离子化合物AuPT(Ⅰ)，发现其可以明显抑制DUB活性，而在一定剂量范围内对20S蛋白酶体活性没有抑制作用。研究表明与20S蛋白酶体相比，DUB对蛋白的降解具有更好的选择性和特异性，成为抗肿瘤的新靶点[4]，但目前尚未有应用于临床治疗疾病的DUB抑制剂。本课题将进一步确证AuPT(Ⅰ)对DUB的抑制作用及其具体靶点，并全面研究AuPT(Ⅰ)是否具有明显的抗肿瘤效应及其与DUB抑制的关系，进一步探索AuPT(Ⅰ)能否作为DUB抑制剂开发成临床抗肿瘤药物。
研究目的：
1、明确AuPT(Ⅰ)的DUB抑制效应及其具体靶点；
2、明确AuPT(Ⅰ)抗肿瘤效应与DUB抑制作用的关系。
研究方法
1、细胞活力检测：MTS法检测AuPT(Ⅰ)对肿瘤细胞活力的影响。
3、细胞凋亡检测：流式细胞检测仪检测AnnexinV-FITC/PI染色的细胞凋亡情况，倒置荧光显微镜下动态观察AnnexinV-FITC/PI标记的细胞形态学变化情况。
4、相关蛋白的检测：WesternBlot法检测UPS相关蛋白及细胞凋亡相关蛋白的变化。
5、蛋白酶体相关蛋白酶活性检测：多功能荧光酶标仪检测20S蛋白降解酶及26S去泛素化酶的底物降解情况。
6、裸鼠肿瘤模型实验：A549、NCI-H1299细胞接种于SPF级裸鼠右侧腋窝皮下，AuPT(Ⅰ)每日腹腔注射，观察肿瘤变化及裸鼠活动情况。
7、免疫组化：检测裸鼠肿瘤组织中相关蛋白变化情况。
研究结果：
1、AuPT(Ⅰ)对肿瘤细胞的毒性
1)AuPT(Ⅰ)抑制肿瘤细胞活力
选用人胃腺癌细胞MGC-803、SGC-7901及人非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H1299为研究对象，不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用24、48、72h后，MTS法检测细胞活力，结果显示，AuPT(Ⅰ)明显抑制肿瘤细胞活力，且呈浓度和时间依赖性。
2)AuPT(Ⅰ)诱导肿瘤细胞凋亡
不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用人胃腺癌细胞MGC-803、SGC-7901、非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H129924h，AnnexinV-FITC/PI双染的阳性细胞明显增多，并伴有典型的细胞凋亡形态学变化；AnnexinV-FITC/PI流式检测结果也显示AuPT(Ⅰ)能够明显诱导肿瘤细胞凋亡。
3)AuPT(Ⅰ)引起肿瘤细胞内死亡相关蛋白的增加
不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用人胃腺癌细胞MGC-803、SGC-7901、非小细胞肺癌A549、NCI-H1299一定时间，免疫印迹结果显示随着浓度增高和时间增加，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9前体明显减少，活化带逐渐增多；PARP前体减少，切割带出现。
2、AuPT(Ⅰ)抑制蛋白酶体功能
不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用人胃腺癌细胞MGC-803、SGC-7901、非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H1299一定时间、稳定转染GFPu的HEK-293细胞6h。结果显示，AuPT(Ⅰ)可以浓度依赖性引起肿瘤细胞内总的泛素化蛋白、K48-链接的多聚泛素化蛋白及26S蛋白酶体特异性外源性蛋白GFPu浓度依赖性聚集增加。
3、AuPT(Ⅰ)抑制蛋白酶体功能的靶点位于DUBs
1)AuPT(Ⅰ)对20S蛋白酶体功能无明显影响
以不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用于细胞提取裂解液蛋白，加入相应的酶解底物，多功能酶标仪(350/438 nm)检测AMC释放的荧光强度。结果表明，AuPT(Ⅰ)对细胞内20S蛋白酶体的半胱天冬蛋白酶样(Caspase-like)、胰蛋白酶样(Trypsin-like)、糜蛋白酶样(Chymotrypsin-like)酶解活性无影响。
2)AuPT(Ⅰ)抑制26S蛋白酶体功能
以不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用于纯化的26S蛋白酶体和细胞提取裂解液蛋白，加入Ub-AMC，多功能酶标仪(350/438 nm)检测，观察DUB活性的动态变化。结果显示AuPT(Ⅰ)更明显的抑制26S蛋白酶体去泛素化酶的活性。
3)AuPT(Ⅰ)靶向作用于26S蛋白酶体相关去泛素化酶UCLH5和USP14
不同浓度的AuPT(Ⅰ)作用于纯化的26S蛋白酶体，加入UbVS，Westernblot检测HA水平，结果显示，AuPT(Ⅰ)能竞争UbVS对UCLH5和USP14活性位点占据。
4、AuPT(Ⅰ)通过抑制蛋白酶体功能从而诱导细胞凋亡
用AuPT(Ⅰ)2μM分别处理A549、NCI-H1299细胞后，在指定时间收集细胞提取总蛋白，采用WesternBlot法检测Ub-Prs.、PARP的表达情况。结果显示AuPT(Ⅰ)在处理细胞6小时后出现泛素化蛋白和蛋白酶体底物的大量聚集，而指示细胞出现凋亡的PARP则在12小时后才出现切割带，这些结果说明AuPT(Ⅰ)诱导的细胞凋亡出现在蛋白酶体功能抑制之后。
5、AuPT(Ⅰ)可选择性诱导白血病细胞细胞凋亡并抑制其蛋白酶体功能
用不同浓度的AuPT(Ⅰ)处理7例白血病病人(Pt)和6例正常人外周血液的单个核细胞，用MTS法、流式细胞术检测和荧光显微镜拍照，结果显示AuPT(Ⅰ)可剂量依赖性地诱导白血病病人外周血单个核细胞的凋亡，对正常人外周血单个核细胞活力抑制的IC50值高于白血病病人，将近5倍。Westernblot结果显示经过AuPT(Ⅰ)处理的白血病病人外周血单个核细胞总的泛素化蛋白聚集明显增多。表明与正常人单个核细胞相比，AuPT(Ⅰ)更为明显的抑制白血病病人单个核细胞蛋白酶体功能并诱导产生更明显的细胞毒性作用。
6、AuPT(Ⅰ)可明显抑制裸鼠移植瘤(A549、NCI-H1299)的生长并诱导肿瘤组织中泛素化蛋白的表达
裸鼠肿瘤模型实验结果显示AuPT(Ⅰ)可显著抑制裸鼠移植瘤的生长。采用免疫组化方法检测肿瘤组织中Ub-Prs、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase8均增加，说明在体实验中AuPT(Ⅰ)抑制了肿瘤组织细胞蛋白酶体功能并诱导其凋亡。
研究结论：
1、AuPT(Ⅰ)主要通过抑制DUB活性从而引起蛋白酶体功能的抑制；
2、AuPT(Ⅰ)对DUB的抑制作用是其抗肿瘤效应的主要机制。