论文部分内容阅读
紫外线B（UV-B）辐射胁迫同干旱、冷害、盐碱等胁迫一样,会对植物的生长发育产生严重的影响。类病斑突变体通常是研究植物抵御外界病原菌侵染机理的理想材料。目前关于UV-B辐射对水稻的影响及类病斑形成的研究虽有报道,但对OsGLP1突变引发依赖于UV-B的水稻株型改变及叶片出现类病斑的研究尚未报道。本文旨在明确OsGLP1突变导致水稻株型改变和叶片类病斑形成的原因和机理,所得结果如下:（1）UV-B是glp1突变植株叶片形成类病斑的必需条件自然光照下（含UV-B）,glp1突变植株从四叶期起倒数第三片叶开始出现褐色的斑点,台盼蓝染色显示斑点部位细胞死亡。但将其置于白光(600μmol m-2 s-1,0μW cm-2,30℃)、高光强(800μmol m-2 s-1,0μW cm-2,30℃)、高温(600μmol m-2 s-1,0μW cm-2,42℃)、低温(600μmol m-2 s-1,0μW cm-2,8℃)环境条件下培养时,glp1突变体植株叶片均不出现类病斑;如将其置于含50-80μW cm-2 UV-B的白光下(600μmol m-2 s-1,30℃)培养5 h时,glp1突变体植株叶片上又出现类病斑。DAB或NBT染色显示glp1突变体植株叶片中的H2O2和O2.-含量较野生型DJ和过表达OsGLP1水稻转基因植株低;MV处理显示glp1突变体植株的抗氧化胁迫能力与野生型DJ和过表达OsGLP1水稻转基因植株无明显差异。因此,UV-B是glp1突变体植株类病斑形成的必需条件,类病斑的形成与氧化胁迫无关。（2）OsGLP1突变引发水稻对UV-B敏感与野生型相比,生长在自然光照下（含UV-B）的glp1突变体植株表现出植株矮化、分蘖数减少、旗叶叶夹角增大的表型;生长在无UV-B白光下的glp1突变体植株的表型与野生型DJ无明显差异;生长在玻璃温室中（UV-B强度为自然光照的20%）的glp1突变体植株与野生型DJ相比叶夹角略有增加,但株高和分蘖数无明显变化。过表达OsGLP1转基因株系在上述条件下,表型与野生型均无明显变化。因此,UV-B是glp1突变体植株株型改变的必需条件。自然光照下,glp1突变体植株叶片的叶绿素含量、叶绿素a/叶绿素b比值、净光合速率、气孔导度、Fv/Fm、Y（I）和Y（Ⅱ）均比野生型DJ小,而过表达OsGLP1水稻转基因植株叶片中上述参数与野生型均无明显差异。此外,RNA-seq和qRT-PCR均显示反映水稻对UV-B敏感的指标OsCPDP和OsCPDPL的表达量较野生型DJ低。上述结果表明OsGLP1突变引发水稻对UV-B敏感。（3）OsGLP1的表达不受UV-B诱导构建过表达载体pOx-OsGLP1-GFP,采用农杆菌介导法侵染水稻组织愈伤,获得过表达GLP1-GFP的植株。将过表达GLP1-GFP的植株暗培养7 d,取其叶鞘幼嫩部位进行观察。白光下,OsGLP1定位在细胞内,且荧光强度较强;UV-B辐射下,OsGLP1-GFP的荧光向细胞边缘靠拢,且荧光较白光下（不含UV-B）减弱。但Western blotting结果显示50-80μW cm-2的UV-B辐射对过表达GLP1-GFP水稻植株和野生型DJ叶片中OsGLP1的表达并无显著影响,仅在UV-B辐射3 h后,OsGLP1-GFP和OsGLP1的表达量略有减少。（4）OsGLP1突变导致生长在自然光下的水稻植株内源生长素含量降低外施2,4-D或NAA处理可使野生型DJ幼苗叶片中OsGLP1的表达明显提高。自然光照下,glp1突变体植株表现出植株矮化、旗叶叶夹角增大的典型的生长素缺乏表型。pDR5:GUS法分析表明glp1突变株系叶枕中的生长素含量较野生型DJ低,而过表达OsGLP1转基因植株与野生型DJ无明显差异。RNA-seq数据分析表明,当glp1突变植株生长在不含UV-B的白光下时,生长素响应基因Aux/IAA家族成员,如OsIAA1、OsIAA10、OsIAA24等的表达水平与野生型无明显差异;当其在自然光照下生长8 h时,上述基因的表达明显低于野生型。因此,自然光照下glp1突变体株型的改变可能是由于水稻植株内源生长素含量降低引起的。（5）OsGLP1可能参与水稻对UV-B的信号传导qRT-PCR和RNA-seq结果显示,当将glp1突变体从不含UV-B的白光下移到自然光照下培养8 h时,其叶片中OsPIF3的表达量低于野生型DJ的。此外,RNA-seq数据还显示,glp1突变体中与黄酮类代谢相关基因（Os10g0317900、Os10g0317950、Os10g0320100、Os10g0320201）的表达水平在不含UV-B的白光下与野生型无明显差异,但在自然光照下生长4 h、8 h时,其叶片中上述基因的表达水平明显低于野生型,OsMAPK3、OsMAPK6、OsMAPK12、OsMAPK13和OsCIPK3的表达则表现出不同程度的上调。而上述基因均参与UV-B信号的传导。因此,OsGLP1可能参与水稻对UV-B的信号传导。（6）OsGLP1可能在水稻抵抗白叶枯病原菌中具有一定的作用水稻孕穗期旗叶在接种白叶枯菌株IV后4 h、12 h、20 h时,OsGLP1的表达水平均有提高,其中4 h时,OsGLP1的表达显著提高。过表达OsGLP1的转基因植株乳熟期旗叶叶片在接种白叶枯生理小种IV、GDIV或PXO99两周后,叶片病斑相对长度均较野生型（DJ）的短,而glp1突变株系病斑相对长度较野生型（DJ）的长,这说明OsGLP1在水稻抵抗白叶枯菌IV、GDIV和PXO99中具有一定的作用。