【研究背景及目的】肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生率占恶性肿瘤的第五位，而死亡率高居第三位。我国是肝癌的高发地区，而临床上肝癌患者疾病进展迅速，手术切除仍然是改善肝癌预后最主要手段，对于不能切除的患者采用介入手段局部治疗和/或放疗、化疗、生物综合治疗等手段，对于改善预后有一定的作用。但是总体来说，肝癌的预后较差，临床治疗除手术切除治疗外，其他的治疗手段疗效有限，临床迫切需要寻找新的治疗方案。肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factors,HNFs）家族包括一系列肝富集的转录因子（liver-enriched transcription factors,LETFs），如：HNF1，HNF3，HNF4，HNF6，C/EBP等。HNFs在分化成熟的肝细胞中高表达，在转录水平调控很多肝脏重要功能基因表达，促进肝细胞分化，维护肝细胞生物学功能，并在肝脏发育中发挥重要作用。既往研究表明HNFs表达与HCC发生、发展密切相关，我们的研究表明上调HNFs家族重要成员HNF4α表达不但可以通过逆转肝细胞的EMT来抑制肝硬化，而且可以通过抑制Wnt/β-cantanin信号通路来预防肝癌。此外，HNF1α和HNF4α可以通过促进肝肿瘤细胞向成熟肝细胞方向转化，发挥治疗肝癌作用。CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer-binding protein alpha,C/EBPα）是HNFs家族的另一重要成员，其在肝脏细胞增殖、分化、应激反应、能量代谢、氨和胆红素解毒等中发挥重要作用。既往多项研究表明C/EBPα在肝癌的发展过程中起抑癌的作用。然而最近有研究表明，在比较肝癌和癌旁组织标本，发现C/EBPα明显上调，通过小干扰基因敲除C/EBPα表达后，可抑制cyclinA，CDK4及E2F表达，抑制肝癌发展。因此，C/EBPα在肝癌中的确切作用还有待于进一步研究。基于C/EBPα在HCC发生发展中的重要作用及C/EBPα在肝脏发育和肝细胞分化过程中的重要地位，在本研究中我们比较正常成熟人肝细胞、不同肝肿瘤细胞株、人HCC组织及HCC癌旁组织之间C/EBPα的表达差异；证实C/EBPα与HCC发生发展相关的基础上，利用AdEasyTM系统构建表达C/EBPα的重组复制缺陷型腺病毒－AdC/EBPα；将AdC/EBPα体外感染肝肿瘤细胞株，检测其对肝肿瘤细胞株肝细胞相关功能基因表达的影响，观察肝肿瘤细胞株增殖、凋亡和成瘤能力的变化；构建不同实验性HCC小鼠模型，分别经瘤内或尾静脉注射导入AdC/EBPα，观察上调C/EBPα在体内对实验性小鼠HCC的治疗作用，并进一步明确其治疗肝癌的分子机制，为HCC的临床治疗提供新的思路和方法。【实验方法】一、检测C/EBPα在肝肿瘤细胞和人肝癌组织表达情况Real-timeRT-PCR方法检测人正常成熟肝细胞、不同人肝肿瘤细胞株Hep3B、Huh-7、MHCC-LM3、YY-8103的C/EBPα基因的表达情况，同法检测20例人HCC组织及其癌旁组织C/EBPα基因表达差异。二、构建重组复制缺陷型腺病毒AdC/EBPα将pAdTrack-CMV与获得的C/EBPαcDNA片段均经HindIII、XholⅠ酶切后连接，获得质粒pAdTrack-CMV-C/EBPα，将PmeI酶切线性化的pAdTrack-CMV-C/EBPα与pAdEasy-1质粒共转化BJ5183感受态细菌同源重组，PacI酶切筛选出pAdC/EBPα，并测序验证目的基因序列的正确性。PacI酶切线性化的pAdC/EBPα转染293细胞，反复感染、冻融293细胞，获得AdC/EBPα，以同样方法获得对照病毒AdGFP。三、上调C/EBPα表达对肝肿瘤细胞生物学特性的影响1.AdC/EBPα感染肝肿瘤细胞株Huh7细胞对C/EBPαmRNA和蛋白表达影响：病毒AdC/EBPα和AdGFP分别以MOI400感染肝肿瘤细胞株Huh7细胞，荧光显微镜下观察GFP表达，明确腺病毒的感染效率；Real-Time RT-PCR、Westernblot、免疫荧光化学法检测C/EBPα在肿瘤细胞株中的表达量及定位。2.外源导入C/EBPα后，Real-Time RT-PCR检测其对肝肿瘤细胞Huh7的肝细胞相关功能基因表达的影响：转染C/EBPα小干扰片段后，Real-Time RT-PCR检测其对Huh7的肝细胞相关功能基因表达的影响。3.外源导入C/EBPα后，CCK-8方法绘制Huh7细胞生长曲线，明确对肝肿瘤细胞株Huh7细胞增殖的影响。4.病毒AdC/EBPα和AdGFP感染Huh7细胞株后，流式细胞仪检测肝肿瘤细胞凋亡率、细胞周期变化。5.外源导入C/EBPα对肝肿瘤细胞克隆形成能力的影响：病毒AdC/EBPα和AdGFP分别感染肿瘤细胞株Huh7细胞24h后，各取4×103细胞接种于10cm培养皿，2w后观察肿瘤细胞克隆形成情况。6.体外分离原代人肝癌细胞及肿瘤相关的成纤维细胞，检测AdC/EBPα和AdGFP分别感染后对其存活率的影响。7.裸鼠皮下成瘤实验：4-6周的BALB/c裸鼠购置于中国科学院上海动物实验中心，并于SPF级动物房饲养。将感染病毒AdGFP和AdC/EBPα的肝肿瘤细胞Huh7细胞重悬成4×10⁶/200μl，分别注射至裸鼠颈背部左右两侧皮下，用游标卡尺测量肿瘤的体积：体积=长×宽2×0.5。共观察6周裸鼠成瘤情况。四、C/EBPα治疗小鼠实验性肝癌1.C/EBPα治疗小鼠皮下种植瘤Huh7细胞以4×10⁶/侧分别种植于裸鼠颈背部左右两侧皮下。2周后待双侧肿瘤形成后，分别经皮下瘤内注射AdGFP和AdC/EBPα，每周3次，连续2周，并观察肿瘤的生长情况，治疗结束后处死小鼠，分别记录瘤重，小鼠体重。1.C/EBPα治疗小鼠肝内原位种植瘤Huh7细胞以4×10⁶/只注射于裸鼠肝包膜下，构建肝脏原位种植性肝癌小鼠模型；分别经尾静脉注射导入AdGFP和AdC/EBPα，每周2次，观察肿瘤生长情况。3周后处死小鼠，记录瘤重，并用免疫组织化学法分别检测肿瘤中C/EBPα、PCNA、Ki67表达情况。五、C/EBPα对Notch1/Hes1/p27信号通路的作用1.通过细胞免疫组化及Westernblot检测C/EBPα对Notch1蛋白水平的影响，并进一步检测对其核转移的影响；检测过表达C/EBPα对Notch信号通路下游基因的表达的影响。2.利用pcDNA3.0-Hes1过表达质粒，检测上调Hes1对C/EBPα抗肿瘤增殖作用的影响；进一步采用过表达Notch1的胞内段NICD，激活Notch1信号通路后再过表达C/EBPα，以明确C/EBPα在Notch1信号通路的作用。3.进一步验证Notch1/Hes1/p27信号通路在体内的作用，我们利用肝脏种植性肝癌小鼠模型，分别感染AdGFP和AdC/EBPα治疗2周后，检测了Hes1和p27在肝癌组织中的表达情况。六、统计学处理数据采用SPSS16.0统计软件包进行分析，结果以X±SD表示。多组间采用One-WayANOVA分析，方差非齐性则采用非参数检验；P<0.05为统计学有显著性差异，P<0.01为具有非常显著性差异。【实验结果】一、C/EBPα在肝肿瘤细胞和肝癌组织中表达明显下降1.Real-TimeRT-PCR结果显示C/EBPα基因在正常肝细胞和不同肝肿瘤细胞株中表达存在明显的差异。在肝肿瘤细胞株Hep3B、Huh-7、MHCC-LM3、YY-8103表达均明显下调，而在正常肝细胞中表达较高（P<0.05）。2.Real-TimeRT-PCR法比较20对人HCC组织/癌旁组织C/EBPα基因表达情况。结果显示：C/EBPα在大部分肝癌组织中表达明显低于癌旁组织，其中60%（12/20）患者肝癌组织的C/EBPα表达较癌旁组织明显下调，25%肝癌组织的C/EBPα表达上调，15%未见明显变化，。3.免疫组织化学法检测6例人HCC组织/癌旁组织中，4例HCC组织C/EBPα表达表达较癌旁组织降低，1例无明显差异，1例HCC组织中C/EBPα表达较癌旁组织稍有上调。二、成功构建重组复制缺陷型腺病毒AdC/EBPα质粒pcDNA3.1-C/EBPα经酶切后，体外连接获得穿梭质粒pAdTrack-CMV-C/EBPα，同源重组后筛选获得AdC/EBPα；经293细胞包装并反复感染、冻融，获得1×10¹⁰表达形成单位/ml（efu/m1）滴度的AdC/EBPα。三、C/EBPα调控肝肿瘤细胞生物学特性1.AdC/EBPα感染肝肿瘤细胞后上调C/EBPαmRNA和蛋白表达病毒AdC/EBPα和AdGFP分别以MOI400感染肝肿瘤细胞株Huh7细胞3天后，荧光显微镜下可见95％以上的细胞表达GFP；Real-TimeRT-PCR、Westernblot检测C/EBPα表达明显上调；免疫荧光化学法显示C/EBPα表达明显上调，且主要定位在核内。2.C/EBPα上调肝肿瘤细胞部分肝细胞相关功能基因表达Real-Time RT-PCR检测发现AdC/EBPα感染肝肿瘤细胞Huh7后，部分肝细胞相关功能基因表达上调，主要包括PEPCK，CPS1，CYP2C9，CYP2D6，CYP3A4，CYP3A7，GK，GYS2，OAT，TAT，TTR及UGT1A6，而ALB，GS和APROA1未见明显上调。小干扰C/EBPα后，CYP3A4，CPS1，OAT，GYS2，ALB，GS，TTR等肝功能基因表达明显下调。3.C/EBPα抑制肝肿瘤细胞增殖AdC/EBPα感染Huh7细胞后，其增殖较AdGFP组及空白对照组均明显减缓，AdC/EBPα作用3天后既开始出现生长抑制，而到6天出现更为明显的生长抑制。4.C/EBPα诱导Huh7细胞株细胞周期阻滞在G1/S期AdC/EBPα和AdGFP分别感染Huh7细胞96h后，流式细胞仪检测表明：上调肝肿瘤细胞C/EBPα表达后，Huh7细胞株凋亡率无明显差异（P>0.05），而细胞周期的比例差异显著，其中对照AdGFP组S期细胞比例为41.78%±1.67%,治疗AdC/EBPα组S期细胞比例下降为29.37%±1.115%（P<0.05）。5.C/EBPα降低肝肿瘤细胞克隆形成能力克隆形成实验证实，病毒感染Huh7细胞后，AdC/EBPα组细胞克隆数明显低于AdGFP组（P<0.05）。6.C/EBPα明显降低原代人肝癌细胞及肿瘤相关的成纤维细胞的存活率AdC/EBPα和AdGFP病毒分别以不同的MOI感染人原代肝癌细胞（LIX006，LIX010）7天后，明显抑制肝癌细胞细胞存活。AdC/EBPα和AdGFP病毒分别以不同的MOI感染肿瘤相关成纤维细胞（L00908B，L100825）7天后明显降低肿瘤相关成纤维细胞存活率。7.C/EBPα显著抑制肝肿瘤细胞的体内成瘤能力将感染病毒AdGFP和AdC/EBPα的细胞分别注射至裸鼠颈背部左右两侧皮下后，两组间成瘤情况有明显差异（P<0.05）。其中皮下注射Huh7成瘤实验中，6周时8只裸鼠AdC/EBPα侧均无肿瘤生长，而对照侧（AdGFP侧）均有肿瘤生长。四、C/EBPα显著抑制肝癌生长1.瘤内注射AdC/EBPα治疗裸鼠皮下肝癌种植瘤Huh7以4×106/侧皮下注射14天可成瘤，注射病毒2周后AdGFP侧和AdC/EBPα侧肿瘤大小分别为（3581.79±1248.7）mm³、（1553.41±432.05）mm³，瘤重分别为（1.39±0.58）g、（0.62±0.185）g，AdC/EBPα组明显小于AdGFP组（P<0.05）。2.经尾静脉注射AdC/EBPα治疗裸鼠肝脏种植性肿瘤模型Huh7肝脏注射14d后原位见白色点状肿瘤生长。经尾静脉注射病毒3w后，AdGFP组5只小鼠肝脏均有肿瘤生长，其中2只出现血性腹水。AdC/EBPα组5只小鼠中，3只小鼠肝脏有肿瘤生长，2只未见肿瘤生长，均未出现明显腹水。免疫组织化学法检测显示AdC/EBPα组C/EBPα表达明显强于AdGFP组，肿瘤内PCNA、Ki67表达明显低于AdGFP侧。五、C/EBPα抑制Notch1/Hes1/p27信号通路1.过表达C/EBPα可明显抑制Notch1的表达水平。Westernblot方法检测发现，上调表达C/EBPα后明显抑制Notch1的蛋白表达水平。通过核浆分离蛋白电泳进一步验证发现，Notch1蛋白主要在细胞核内表达明显下调，而胞浆中未见明显下调。2.过表达C/EBPα可明显抑制Notch1信号通路下游靶基因的表达。Real-TimeRT-PCR结果显示过表达C/EBPα抑制Notch1后，明显下调Notch1通路下游靶基因c-Myc、cyclinD1、Hes1的表达。并在蛋白水平进一步验证主要的靶基因HES1明显下调，且核内的表达降低明显。3.过表达C/EBPα抑制Notch1蛋白，下调靶基因Hes1表达，进而上调p27蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。Real-TimeRT-PCR及蛋白水平共同验证过表达C/EBPα明显上调p27的表达。过表达Hes1，可部分抵消C/EBPα抗肝癌细胞株Huh7增殖的效应。而过表达NICD后，C/EBPα则不能发挥抑制Notch1通路的作用。4.经尾静脉注射AdC/EBPα及对照病毒AdGFP治疗裸鼠肝脏种植性肿瘤2周后，免疫组化结果证实，AdC/EBPα治疗组Hes1表达较对照组AdGFP明显降低，而p27明显升高。【结论】1.在肝肿瘤细胞株及大部分人HCC组织中，C/EBPα表达明显下调。2.利用AdEasyTM系统构建的重组复制缺陷型腺病毒AdC/EBPα可高效表达C/EBPα。3.AdC/EBPα可诱导肝肿瘤细胞向成熟肝细胞分化，诱导细胞周期阻滞在G1/S期，抑制肿瘤细胞增殖及克隆形成能力，并显著降低肝肿瘤细胞体内成瘤能力。4.AdC/EBPα有效抑制皮下种植性肝癌模型及原位种植性肝癌模型的肝癌生长。5.C/EBPα治疗肝癌的分子机制为抑制Notch1/HES1/p27信号通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖。6.C/EBPα有望成为治疗肝癌的有效药物。