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天花粉蛋白(TCS)具有多种药理学特性,包括中期流产、抗人HIV病毒和诱导多种肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤活性。已有研究结果表明,TCS诱导JAR内ROS产生、细胞内钙离子浓度波动、caspase-3活化和凋亡;TCS抑制HSV-1感染的Vero细胞内MAPK和Bcl-2信号通路,进而抑制细胞复制。此外,TCS通过抑制PKC活性而诱导K562细胞凋亡。我们实验室的研究发现,TCS能够诱导Hela细胞形态学改变,包括微绒毛消失、细胞膜发泡,染色质浓缩和凋亡小体形成;TCS抑制细胞增殖的机制与细胞周期S期阻滞和诱导细胞内capsase凋亡通路活化有关。这些研究结果初步证实Hela细胞是TCS的敏感细胞之一,但TCS诱导Hela细胞凋亡过程中的细胞和分子机制仍需做深入的研究。鉴于此,本课题在原有的实验基础上,进一步研究了TCS诱导HeLa细胞凋亡过程中细胞骨架的改变、相关信号转导通路或靶点、转录因子环磷酸腺苷反应结合蛋白(CREB)在调节Bcl-2蛋白表达水平的作用,以便从细胞和分子水平上揭示TCS诱导Hela细胞凋亡的机理,为天花粉蛋白在肿瘤防治中的应用,提供重要的理论和实验依据。研究目的通过研究TCS诱导Hela细胞凋亡过程中细胞骨架的排列、骨架蛋白和基因表达的改变、以及相关信号转导通路或靶点,阐明TCS诱导Hela细胞凋亡的细胞和分子机制。研究方法采用CCK-8的方法,检测TCS对HeLa细胞的抑制作用;在confocal免疫荧光显微镜下,观察TCS诱导Hela细胞内细胞骨架微管(MT)和微丝(MF)的改变;利用western blot检测TCS对细胞骨架蛋白表达的影响,real-timePCR检测TCS对细胞骨架actin和tubulin亚型基因表达的影响;电子显微镜和Annexin/PI双染观察TCS对HeLa细胞诱导凋亡的作用;Fura-4荧光探针检测TCS诱导Hela细胞内钙离子水平的改变;腺苷酸环化酶(AC)、PKA、PKC、ERK、p38-MAPK蛋白激酶抑制剂或激活剂检测这些激酶在TCS抑制HeLa细胞增殖中的作用;用反义环磷酸腺苷反应结合蛋白(CREB)核苷酸敲除法和cAMP反应原件(CRE)诱骗(decoy)寡核苷酸(ODN)法,验证TCS是否通过调节转录因子CREB对Bcl-2蛋白的表达产生影响。研究结果(1)TCS诱导Hela细胞凋亡伴随着MF解聚和质膜下“环状”MT结构的形成;TCS抑制细胞骨架actin和tubulin亚型基因的表达,但不影响actin,α-tubulin和β-tubulin蛋白的表达。(2)钙离子螯合剂破坏TCS诱导的“环状”MT结构,但不影响TCS引起的MF解聚;而且钙离子螯合剂和TCS联合处理,显著性增加LDH的释放。(3)TCS诱导的细胞外钙离子内流,抑制细胞内腺苷酸环化酶的活性和细胞内cAMP的形成;PKC活化剂显著性拮抗TCS抑制的腺苷酸环化酶的活性和细胞内cAMP的水平;TCS抑制的p-CREB表达能够被cAMP异构体拮抗;然而,PKC/ERK/MAPK抑制剂阻滞了cAMP异构体的拮抗效应。(4)反义CREB核苷酸敲除法和CRE诱骗ODN法,有效阻滞了TCS对Bcl-2蛋白的调节作用。结论(1)TCS诱导Hela细胞凋亡伴随着MT“环状”结构的形成和抑制细胞骨架actin和tubulin亚型基因的表达,但不影响actin和tubulin蛋白表达的改变。(2)TCS诱导细胞内钙离子的升高参与调节和维持细胞内MT“环状”结构的形成与凋亡过程中细胞膜的完整性。(3)TCS诱导的细胞内钙离子升高,参与抑制Hela细胞内cAMP/PKC/MAPK/CREB活性,进而抑制细胞增殖。(4)TCS抑制的CREB磷酸化对调控Bcl-2基因表达起主要作用。这些结果为理解TCS诱导凋亡的细胞和分子机制提供了新的思路。