【摘 要】
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目的:采用TaqMan MGB探针技术建立一种检测人巨细胞病毒(HCMV)感染的实时荧光定量PCR新方法。方法:1.从GenBank中选择病毒复制所必需的在各株间具有高度保守性的HCMV即刻早期
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目的:采用TaqMan MGB探针技术建立一种检测人巨细胞病毒(HCMV)感染的实时荧光定量PCR新方法。方法:1.从GenBank中选择病毒复制所必需的在各株间具有高度保守性的HCMV即刻早期基因(IE基因)启动子的第四个外显子(HCMV MIE exon 4)序列进行引物设计,同时考虑这段序列符合实时定量PCR引物及探针设计的要求。通过PCR扩增得到201bp大小的DNA片段,并将其克隆入pMD18-T载体(TA克隆)构建重组质粒作为实时定量PCR定量的标准品。2.以构建的重组质粒为模板,探讨实时定量PCR的最佳循环参数(反应条件)及反应体系,建立最优化的实时定量PCR方法,并对其进行方法学评价(包括重复性、特异性、线性范围等)。3.将构建的实时定量PCR法用于检测临床标本,并与ELISA法、普通PCR法及病毒分离法比较,以验证所构建方法的临床应用价值。结果:1.经TA克隆成功地构建了重组质粒,经PCR鉴定与预期结果一致。核酸序列测定显示插入的HCMV MIE exon 4扩增片段与GenBank报道的序列完全吻合。2.以重组质粒为模板,确定了实时定
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