论文部分内容阅读
第一部分:脂毒性对胰岛β细胞自身胰岛素信号通路及分泌功能的影响及机制目的:探讨高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的变化及机制。方法:将8周龄雄性SD大鼠随机分为高脂饲料组(HF组,20只)和正常饲料组(NC组,20只)。各组分别饲养至20周,(1)采空腹血检测血糖、胰岛素,测血中及胰腺组织甘油三酯含量;胰腺组织切片行HE染色;(2)胰岛细胞表面灌注实验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能;(3)正常血糖高胰岛素钳夹试验,评价外周组织胰岛素抵抗程度;(4)采用实时荧光定量PCR方法比较两组大鼠胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)、磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)和葡萄糖转运子-2(Glut-2)mRNA表达的变化。结果:(1)HF组胰岛素、血中和胰腺组织TG水平显著高于NC组(P＜0.01);高脂组大鼠胰岛内可见脂质沉积;(2)HF组大鼠葡萄糖输注率(GIR)较NC组明显降低(P＜0.01);HF组葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能明显降低;(3)HF组胰岛细胞IRS-1 mRNA表达降低42.3%,IRS-2及PI3K分别降低28.1%、16.8%,Glut-2mRNA表达降低22.9%,(P均＜0.05)。(4)相关分析显示:胰腺组织TG水平与胰岛细胞IRS-1 mRNA表达呈负相关(r=—0.623,P＜0.05);且与IRS-2 mRNA表达也明显负相关(r=—0.537,P＜0.05)。结论:高脂饲养导致大鼠胰岛β细胞胰岛素信号转导分子基因表达下降,可能与胰腺组织TG的异位沉积有关。第二部分:大剂量抗氧化剂对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及机制目的:探讨大剂量抗氧化剂—N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及可能机制。方法:8周龄SD大鼠随机分为正常饲料组(NC组),高脂饲料组(HF组),和高脂+NAC组(NAC组)。饲养20周,(1)测血浆及胰腺组织丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平;(2)正常血糖高胰岛素钳夹实验,评价外周组织胰岛素抵抗程度;(3)胰岛细胞表面灌注实验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能;(4)实时荧光定量PCR方法比较各组大鼠胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)和葡萄糖转运子-2(Glut-2)mRNA表达的变化。结果:(1)HF组血浆及胰腺MDA水平明显高于NC组,GSH水平低于NC组,NAC可以改善以上变化;(2)HF组葡萄糖输注率(GIR)比NC组降低(P＜0.01),用NAC后GIR明显改善(P＜0.01);HF组葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能下降,用NAC后可逆转上述变化;(3)HF组胰岛细胞IRS-1、IRS-2、Glut-2mRNA表达降低42.3%、28.1%、22.9%(P均＜0.05);NAC组胰岛细胞IRS-1、IRS-2、Glut-2mRNA表达与HF组相比增加40.2%、30.2%,19.1%(P均＜0.05)。结论:大剂量抗氧化干预治疗能改善胰岛细胞胰岛素信号传导,逆转高脂饲养导致的大鼠胰岛细胞分泌功能紊乱,其机制可能与NAC纠正机体氧化及抗氧化失衡有关。第三部分:氧化应激-PI3K/Akt通路与高FFA所致的INS-1细胞分泌功能的紊乱目的:本试验观察了棕榈酸对INS-1细胞胰岛素分泌功能及氧化应激-PI3K/Akt通路的影响及抗氧化剂干预的作用,旨在探讨氧化应激及β细胞自身的胰岛素信号通路在T2DM发病中所起的作用及机制。方法:大鼠胰岛β细胞系接种于6孔板(2×10~5/孔)中,除对照组外,分别加入0.2mmol/L棕榈酸和/或0.2mg/mlNAC以及50nm/L Wortmannin进行干预。各组每24h更换RPMI 1640培养基,细胞达70%汇片生长时,各组细胞分别加入干预,孵育48h。胰岛素释放实验检测β细胞对高糖刺激的反应能力;细胞内硝基酪氨酸测定,反映氧化应激的情况;实时荧光定量PCR检测胰岛素及PDX-1基因表达水平,Western blot检测磷酸化的Akt水平。结果:(1)P组和P+NAC组的ISI较NC组均明显降低,但是P+NAC组的ISI较单独加棕榈酸组明显升高(NC:2.12±0.17;P:0.84±0.12:P+NAC:1.16±0.11,P＜0.05)(2)P组和P+NAC组细胞内胰岛素mRNA表达较NC组细胞分别下降了37.4%(P＜0.05)和22.6%,细胞内PDX-1 mRNA表达分别下降了32.1%(P＜0.05)和27.5%。(3)P组和P+NAC组细胞内NT含量较NC组升高(mmol/l,NC:0.14±0.03;P:0.37±0.02;P+NAC:0.25±0.0.02,P＜0.05)。(4)培养基中加入10nmol/L胰岛素孵育1 h后,P组P-Akt的蛋白表达水平较正常对照组降低,NAC可部分逆转上述变化,加入50nm/LWortmannin后,P-Akt表达受抑制。结论:氧化应激产物增加可能影响胰岛细胞PI3K-Akt活性,使胰岛素信号通路受阻,进而导致胰岛细胞分泌功能障碍。第四部分:胰岛素信号通路在高游离脂肪酸所致的β细胞功能紊乱中的作用及机制目的:观察血浆游离脂肪酸(FFA)水平升高对β细胞胰岛素分泌功能的影响,探讨β细胞胰岛素信号通路在其中所起的作用及机制。方法:将8周龄雄性SD大鼠随机分为脂肪乳输注组(FFA组,13只)和生理盐水输注组(NS组,12只)。分别输注48小时,检测以下指标:(1)采血检测胰岛素,FFA水平。(2)正常血糖高胰岛素钳夹实验,评价外周组织胰岛素抵抗程度。(3)静脉葡萄糖耐量实验,评价活体胰岛β细胞分泌功能。(4)胰岛细胞表面灌注实验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能。(5)采用实时荧光定量PCR方法检测肌肉中胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)mRNA表达的变化。(6)实时荧光定量PCR方法检测胰岛细胞IRS-1、IRS-2和葡萄糖转运子-2(Glut-2)mRNA表达的变化。结果:(1)FFA组血中胰岛素水平比NS组增高(24.44±1.25 uIU/ml VS 18.09±1.37uIU/ml,P＜0.05),FFA水平也显著高于NS组(1.39±0.18mmol/1 VS 0.64±0.10mmol/1,P＜0.001);(2)FFA刺激后,离体和活体的胰岛β细胞分泌功能均增强。(3)FFA组葡萄糖输注率(GIR)较NS组明显降低(P＜0.05),提示存在明显的外周胰岛素抵抗;(4)FFA组肌肉IRS-1 mRNA表达比NS组降低87.7%,IRS-2表达降低50.7%(P均＜0.05)(5)FFA组胰岛细胞IRS-1 mRNA表达增加29.3%(P＜0.05),IRS-2及Glut-2分别增加345.1%、536.4%(P均＜0.01)。结论:血浆FFA水平短期升高,造成外周胰岛素抵抗的同时,对β细胞胰岛素分泌有刺激作用,此时胰岛细胞胰岛素信号通路分子基因表达增加。