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寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是通过蚊虫传播的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科的黄病毒属。寨卡病毒与黄热病毒(YFV)、登革热病毒(DENV)、日本脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)特征相似,在人类中引起轻度乃至严重危害生命的感染。在2007年首次爆发寨卡病毒后,它已成为严重神经并发症的一种重要的人类病理基因,它会造成成人吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)和各种胎儿异常,如小头畸形,引起了人们的普遍关注。目前,全球还尚无针对性的疫苗和药物,寨卡病毒造成的危害已经成了全球公共卫生问题。为了探求新的抑制寨卡病毒的方法,我们运用一种靶向切割RNA病毒的工具CRISPR-Cas13系统抑制寨卡病毒的复制。CRISPR-Cas13系统(以前被成为C2c2)是CRISPR-Cas系统中的第二大类第VI型。该系统类似于CRISPR-Cas9系统,但与靶向DNA的Cas9不同,它是基于细菌免疫系统的RNA靶向编辑系统。CRISPR-Cas13是目前家族中发现的专一靶向RNA的系统,它包含单一的效应蛋白Cas13与CRISPR RNA(cr RNA)组装时形成一个由cr RNA引导的RNA靶向复合物,进行RNA的靶向切割。CRISPR-Cas13系统自发现以来,已经被用于RNA编辑、RNA敲除、RNA检测、RNA追踪及成像等。CRISPR-Cas13系统,例如Cas13a、Cas13b等,它们的RNA敲除技术目前已经被应用到许多领域,如植物RNA病毒——芜青花叶病毒(Tu MV),马铃薯Y病毒(PVY)等;哺乳动物细胞单链RNA病毒敲除——甲型流感病毒(IAV),疱疹性口炎病毒病(VSV)和淋巴细胞性脑膜炎病毒(LCMV)等。这些都已经证明CRISPR-Cas13是破坏RNA病毒有效的工具,CRISPR-Cas13系统将对研究抑制RNA病毒发挥着不可小觑的作用。本研究利用CRISPR-Cas13精确靶向切割单链RNA(ss RNA)的能力,评价CRISPR-Cas13系统对动物细胞感染寨卡病毒的防治作用。通过建立CRISPR-Cas13:g RNA双质粒荧光标记系统,并设计选取寨卡病毒基因组上对应的靶位点,使得CRISPR-Cas13靶向切割寨卡病毒单链RNA基因组。然后利用荧光显微镜技术观察带有荧光标记的寨卡病毒减少量,进一步利用流式细胞分选技术对实验结果进行分析,判断CRISPR-Cas13系统靶向切割寨卡病毒的能力。实验发挥CRISPR-Cas13对RNA病毒抑制的潜在作用,为防治寨卡病毒提供了新的技术工具。首先,我们设计构建了动物细胞CRISPR-Cas13:g RNA双质粒系统模型,其中包括CRISPR-Cas13以及相关g RNA质粒的构建。选用来自Prevotella sp.P5-125的CRISPR-Psp Cas13b,CRISPR-Psp Cas13b蛋白后加上了NES胞质定位信号以及融合了一个绿色荧光蛋白GFP(Psp Cas13b-GFP-NES)。除此以外还构建Psp Cas13b相应靶向寨卡病毒的g RNA质粒,我们在寨卡病毒荧光报告系统基因组上选择了9个靶位点(gpr M、g E、g NS1-1、g NS1-2、g NS2B、g NS3、g NS4B、g NS5和gm C)。然后,我们将构建好的Psp Cas13b-GFP-NES:g RNA-(ZIKV)双质粒系统转染到哺乳动物293T DC-SIGN细胞中,再去感染寨卡病毒荧光报告系统ZIKV-m Cherry。实验结果证明,Psp Cas13b-GFP-NES:g RNA-(ZIKV)双质粒系统可以抑制动物细胞中的寨卡病毒的复制。综上所述,我们的研究证明了CRISPR-Psp Cas13b对寨卡病毒的有效抑制作用。基于CRISPR-Cas13:g RNA在细胞中降解ss RNA的能力,我们开发Psp Cas13b-GFP-NES:g RNA-(ZIKV)双质粒系统来破坏寨卡病毒的复制。这些证据表明,CRISPR-Cas13系统在针对哺乳动物中ss RNA病毒方面具有广泛的潜在用途,将会成为干预RNA病毒的一种有效工具。