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随着对PPARs基因的深入了解,PPARγ在肿瘤中的作用日益成为学者们研究的焦点,有不少研究证明,其激动剂在乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌研究中能够促进肿瘤细胞的凋亡,淋巴结转移是非小细胞肺癌患者术后复发和死亡等预后不良的重要因素。其中PPARγ的特异性配体能诱导多种肿瘤的终末分化,抑制肿瘤细胞的增殖,在脂肪肉瘤和前列腺癌患者的临床治疗中,PPARγ配体已经显示了良好的抑制肿瘤效果。随着淋巴管内皮特异标记物和淋巴管生长因子的发现,NSCLC诱发淋巴管生成的分子机制和以淋巴管生成(lymphangiogenesis)作为抗肿瘤转移靶点的研究已成为目前研究的热点之一,抑制肿瘤新生淋巴管可能为控制非小细胞肺癌淋巴道转移提供新的思路,为此,本研究选择跟PPARγ表达有关的非小细胞肺癌肿瘤细胞系A549细胞,来证实罗格列酮通过下调IGF-1的表达来抑制非小细胞肺癌的淋巴转移及诱导凋亡,意在寻找治疗非小细胞肺癌的一种更好的方法和药物。胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor, IGF)特别是IGF1不仅能够促进非小细胞肺癌的无限增殖,而且与淋巴结转移的关系密切,IGF-1可作为非小细胞肺癌生物学行为尤其是淋巴结转移的判断指标。罗格列酮是过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)激动剂,它能够诱导非小细胞肺癌凋亡并抑制非小细胞肺癌细胞侵袭及转移。并且,罗格列酮已被证明能够通过PI3K/Akt途径抑制乳腺癌细胞中IGF-Ⅰ的表达。据此我们推测罗格列酮可能通过抑制IGF-Ⅰ的来抑制肺癌细胞的淋巴转移。为此,本试验观察罗格列酮作用与A549细胞后IGF-Ⅰ的表达,研究并探讨罗格列酮抑制非小细胞肺癌增值及转移的机制。【研究目的】探讨罗格列酮通过下调IGF-1的表达来抑制非小细胞肺癌的淋巴转移及诱导凋亡。【研究方法】1. A549细胞的培养及罗格列酮对A549细胞的处理;2.采用Hoechst3222染色法检测罗格列酮对肺癌A549细胞凋亡的影响:转染后48小时,Hoechst3222染色,于荧光倒置显微镜下观测胞核变化。分别取5个高倍镜视野,计数凋亡变化的细胞个数所占比例为凋亡率,取平均值,并与空白对照组细胞做比较。重复研究3次;3.透射电镜观察细胞超微结构的改变;4. Real time PCR检测罗格列酮对A549细胞VEGF-C表达的影响;5.采用免疫荧光化学法观察罗格列酮处理A549细胞后VEGF-C的表达;6. Western blot对下调后的IGF-1进行半定量分析:罗格列酮处理细胞24小时后,提取细胞的总蛋白,Bicinchoninic acid assay (BCA)蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。进行SDS-PAGE电泳,目的条带用AlphaEaseFC软件分析系统进行灰度值分析。PPARγ条带与actin条带吸光度的比值表示蛋白表达量;7.对结果进行统计学分析,采用均数±标准差的方式对数据进行描述,凋亡率采用χ2分析,VEGF-C及IGF-1的表达采用方差分析。【研究结果】1.罗格列酮诱导A549细胞凋亡呈浓度依赖性,浓度分别为0,10,20,30μM的罗格列酮,处理48小时后,凋亡率分别为0.012±0.033、0.105±0.177、0.388±0.201、0.437±0.189;A549细胞在在处理后出现早期核凋亡改变,核膜皱缩,成波浪状,染色体凝集成块状。48小时后,凋亡细胞明显增加,染色质致密浓染呈粗大的颗粒状,边集,或整个核呈辐轮状;有些细胞已有凋亡小体突出;或整个细胞核致密浓染,或分裂成凋亡小体。并用透射电镜观察细胞超微结构的改变2.罗格列酮下调VEGF-C的表达,罗格列酮作用48小时后,可见处理组的荧光比空白组明显减弱,而阴性对照组未见特异性荧光表达。3.罗格列酮下调IGF-1的表达成浓度依赖性,罗格列酮处理A549细胞24小时后,IGF-1的表达量分别为0.761±0.006、0.4101±0.0142、0.361355±0.006、0.209±0.018。【研究结论】罗格列酮能够通过下调IGF-1的表达实现其对非小细胞肺癌淋巴转移及增殖的抑制作用,IGF-1可能是存在于诱导细胞凋亡及抑制其转移的关键位点。而罗格列酮能够降低IGF-1的原位表达,为非小细胞肺癌的治疗供新的试验基础及方向。