【摘 要】
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目的:本研究旨在研究针刺干预结直肠“炎-癌”转化在分子层面、细胞层面和动物层面机制,同时研究SIRT1和细胞自噬在结直肠“炎-癌”转化过程中的作用,为电针预防肠道炎症和肠道肿瘤疾病提供科学理论依据。方法:本项目从人体、细胞和动物三个层面研究针刺通过自噬干预结直肠“炎-癌”转化的作用机制。（一）联合转录组测序和生信分析筛选出在正常组和结直肠癌组中差异表达的靶基因,后经过临床样本免疫组化和关键基因临床
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目的:本研究旨在研究针刺干预结直肠“炎-癌”转化在分子层面、细胞层面和动物层面机制,同时研究SIRT1和细胞自噬在结直肠“炎-癌”转化过程中的作用,为电针预防肠道炎症和肠道肿瘤疾病提供科学理论依据。方法:本项目从人体、细胞和动物三个层面研究针刺通过自噬干预结直肠“炎-癌”转化的作用机制。（一）联合转录组测序和生信分析筛选出在正常组和结直肠癌组中差异表达的靶基因,后经过临床样本免疫组化和关键基因临床预后分析,结合肿瘤细胞WB检测,验证差异基因在炎癌转化过程中的作用。（二）运用AOM联合DSS建立小鼠结直肠“炎-癌”转化模型,予以针刺干预同时应用激动剂和抑制剂。将120只C57BL/6J小鼠分为正常对照组,造模组,SIRT1激动剂组,电针治疗组,电针+SIRT1抑制剂组和电针+靶基因抑制剂组。（1）观测小鼠的疾病活动指数（DAI）;（2）在造模的第1周、5周、8周、11周取小鼠结直肠组织,评价“炎-癌”转化模型建立效果。（3）取血和肠道组织做ELISA研究炎症因子的改变,取肠道组织做分子生物学研究:HE染色、免疫组化、免疫荧光、WB、q RT-PCR、CO-IP检测;（4）透射电镜观测自噬小体的改变。（三）选取结直肠癌细胞系进行细胞水平检测,应用SIRT1激动剂、SIRT1过表达质粒、SIRT1 si RNA质粒、关键靶基因过表达质粒、si RNA质粒对结直肠癌细胞系进行干预;同时在机制层面通过完成WB、q RT-PCR、CO-IP、串联亲和纯化/质谱（TAP/MS）、GST pulldown实验和分子对接等相关实验,来探索SIRT1与FOXQ1的调控机制。同时FOXQ1过表达质粒转染LOVO细胞系完成广泛q RT-PCR检测筛选下游差异表达,完成双荧光素酶报告基因实验。结果:1.转录组测序结果显示FOXQ1在小鼠结直肠癌中高表达;通过KEGG富集分析,FOXQ1参与肿瘤的自噬过程;结直肠癌肿瘤细胞验证FOXQ1在CRC细胞中高表达;生信分析结合临床样本验证FOXQ1明显降低结直肠癌患者预后生存率。2.小鼠结直肠“炎-癌”转化模型中,分析小鼠体重变化、DAI评分、肿瘤大小和数目、结直肠长度以及HE检测等结果,结直肠“炎-癌”转化模型建立成功;针刺治疗组、SIRT1激动剂组和FOXQ1抑制组小鼠的生化指标、生存和预后明显优于造模组和SIRT1抑制剂组,造模组和SIRT1抑制剂组无明显的组间差异。WB、q RT-PCR、免疫组化结果显示针刺上调SIRT1表达,同时抑制FOXQ1的表达进而抑制“炎-癌”转化。3.在细胞水平,SIRT1激动剂白藜芦醇和SIRT1过表达质粒均可以促进细胞自噬相关凋亡发生,过表达FOXQ1可以逆转自噬和凋亡的发生;分子对接显示FOXQ1和SIRT1具有较优的分子拟合评分;SIRT1和FOXQ1在蛋白层面存在相互作用;过表达FOXQ1广泛筛选检测下游自噬靶蛋白显示ATG16L具有明显的表达差异,荧光素酶报告基因实验检测证实FOXQ1与ATG16L的3’-UTR直接结合。接下来检测自噬相关指标结果显示,SIRT1过表达可以通过通过抑制FOXQ1促进LC3-II、benlin1、ATG16L表达,抑制p62表达。4.在AOM/DSS诱导结直肠炎癌转化模型基础上,免疫组化证实针刺具有与SIRT1激动剂有协同作用,抑制FOXQ1表达,促进LC3B的表达;免疫荧光结果显示针刺促进LC3B在核内的高表达;透射电镜结果显示针刺明显促进自噬小体的形成,促进自噬的发生;WB结果显示针刺可以明显促进肠道组织中自噬的发生;最后通过CO-IP实验,证实在组织水平针刺促进SIRT1和FOXQ1的直接结合。结论:综上所述,针刺通过激活SIRT1促进与FOXQ1直接结合,进而抑制FOXQ1,促进ATG16L相关自噬,抑制结肠“炎-癌”转化进展。
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