三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl) phosphate, TCEP)是一种常用的阻燃剂和增塑剂。由于TCEP以非共价键的方式结合在高分子材料中,因而极易逸出进入环境。目前,环境样品(室内空气、饮用水和室内灰尘等)和生物样品(斑马鱼、海鸥和人母乳)中已检出TCEP。实验研究表明,TCEP有神经毒性、生殖毒性和内分泌毒性,并可致小鼠肝脏肿瘤。但是,TCEP致肝毒性作用的机制仍不清楚。外源性毒物侵入机体后常诱导过量活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的生成,继而导致蛋白质、DNA、多醣体和脂类等大分子物质的损伤。线粒体是内源性ROS产生与代谢的主要场所,最先受ROS攻击,因而影响细胞的正常分裂和生长,导致细胞的正常生理功能发生紊乱。在调节细胞生长的多条信号通路中,PI3K/Akt/mTOR通路是重要的信号通路之一。P13K被ROS激活后可使膜磷酸肌醇发生磷酸化,继而与Akt的PH区结合促发Akt磷酸化,促发Akt下游分子事件来调节细胞的分裂与生长。不可逆的细胞生长阻滞是细胞衰老的重要表型。氧化应激、线粒体损伤、端粒变短和DNA损伤等经p53-p21-Rb信号通路、DNA损伤反应信号通路和NFκB信号通路调控导致细胞衰老。本文旨在研究TCEP的肝细胞毒性、线粒体毒性以及PI3K/Akt/mTOR通路和p53-p21-Rb通路在TCEP致肝细胞生长阻滞中的调控机制,为阐明TCEP致肝毒性的分子机制提供科学依据。第一部分TCEP致肝细胞毒性的研究目的：研究TCEP的肝细胞毒性。方法：用TCEP (3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L)和DMSO(终浓度<0.1%,溶剂对照)分别处理张氏人肝细胞、人胚肝细胞(L02)和人肝肿瘤细胞(HepG2)24h和48h。检测细胞活力、乳酸脱氢酶释放率、细胞色素P450lAl和3A4酶活力、评价细胞氧化应激(包括胞内ROS、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和还原型胱甘肽／氧化型谷胱甘肽)以及细胞增殖率、细胞周期分布和凋亡率。结果：①TCEP处理三种细胞株24h和48h,张氏人肝细胞所有处理组的细胞活力均下降(P<0.05或P<0.01),但L02细胞仅有200mg/L TCEP处理组的细胞活力分别降至81.64%(P<0.05)和75.80%(P<0.01), HepG2细胞仅在200.00mg/LTCEP处理组细胞活力降至87.30%(P<0.05)和88.49%(P<0.01)：②TCEP处理张氏肝细胞24h,所有处理组细胞LDH释放率升高(P<0.05),在48h仅200mg/L TCEP的细胞LDH释放率为0.48(P<0.05)。TCEP处理L02细胞24h,所有处理组细胞LDH释放率升高(P<0.05或P<0.01),在48h,≥50.00mg/L处理组细胞LDH释放率均升高(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h,所有处理组细胞LDH释放率均升高(P<0.05)),在48h,≥12.50mg.L处理组细胞LDH释放率升高(P<0.05或P<0.01)：③TCEP处理张氏肝细胞24h,仅200.00mg/L处理组的胞内ROS水平升高(P<0.05)。TCEP处理L02细胞24h,仅200.00mg/L处理组的胞内ROS水平升高(P<0.05),在48h,50.00mg/L和200.00mg/L处理组的胞内ROS水平升高(P<0.05)。TCEP处理HepG2细胞24h,50.00mg/L和200.00mg/L处理组胞内ROS水平升高(P<0.05),但在48h,仅200.00mg/L处理组胞内ROS水平升高(P<0.05);④TCEP处理张氏肝细胞24h和48h,≥12.50mg/L处理组GSH/GSSG比值均升高(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理L02细胞24h,仅200.00mg/L处理组的GSH/GSSG比值升高(P<0.05),但在48h所有处理组GSH/GSSG比值均无显著性变化。TCEP处理HepG2细胞24h和48h,所有处理组GSH/GSSG比值均升高(P<0.05或P<0.01);⑤TCEP处理张氏肝细胞24h≥12.50mg/L处理组的细胞增殖均受抑制(P<0.05或P<0.01),不过在48h则所有处理组细胞增殖均受抑制(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理L02细胞24h和48h,所有处理组细胞增殖均受抑制(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h和48h,仅200.00mg/L TCEP处理组细胞增殖受到抑制(P<0.05)：⑥TCEP处理三个细胞株24和48h,所有处理组均未见细胞凋亡。但TCEP处理张氏细胞24h,3.12mg/L和50.00mg/L处理组细胞周期均阻滞在G2/M期(P<0.05),在48h所有处理组细胞周期均阻滞在G2/M期(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理L02细胞24h,3.12mg/L和200.00mg/L处理组细胞周期阻滞在G2/M期(P<0.05),在48h所有处理组均未见细胞周期分布变化。TCEP处理HepG2细胞24h,除200.00mg/L外,其他处理组细胞周期均阻滞在G2/M期(P<0.05或P<0.01),在48h仅200.00mg/L处理组细胞周期阻滞在G0/G1期(P<0.05)。结论：TCEP导致了肝细胞氧化抗氧化失衡,抑制了细胞生长,但未致细胞凋亡。第二部分TCEP促发线粒体信号通路致细胞生长阻滞的调控机制目的：研究线粒体、Sirtuins及PI3K/Akt/mTOR通路在TCEP致肝细胞生长阻滞的调控机制,并揭示SIRT1在TCEP致L02细胞和HepG2细胞生长抑制中的调控机制。方法：用TCEP (3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L)和DMSO(终浓度<0.1%,溶剂对照)分别处理L02细胞和HepG2细胞24h和48h,评价细胞线粒体功能(线粒体内ROS水平、线粒体膜电位、线粒体DNA拷贝数目、细胞内ATP水平和胞内游离Ca2+水平)、Sirtuins蛋白的mRNA和蛋白表达水平以及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达。用SIRT1抑制剂EX-527与TCEP共处理细胞,测定细胞增殖率和PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达。结果：①TCEP分别处理L02细胞和HepG2细胞24h和48h,两个细胞株的所有处理组细胞生长率均降低(P<0.05或P<0.01);②TCEP处理L02细胞24h,≥12.50mg/L处理组胞内T-AOC水平均升高(P<0.05或P<0.01),在48h,则≥50.00mg/L处理组胞内T-AOC水平升高(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h,≥50.00mg/L处理组的胞内T-AOC水平均升高(P<0.05),在48h,≥3.12mg/L处理组胞内T-AOC水平均升高(P<0.05或P<0.01)；③TCEP处理L02细胞24h和48h,仅在48h发现50.00mg/L和200.00mg/L TCEP处理组胞内mtROS水平升高(P<0.05,P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h和48h,≥12.50mg/L TCEP处理组胞内mtROS含量均升高(P<0.05,P<0.01);④TCEP处理L02细胞和HepG2细胞24h和48h,两个细胞株所有处理组的mtDNA数目均下降(P<0.05或P<0.01)；⑤TCEP处理L02细胞和HepG2细胞24h和48h,两个细胞株都仅在24h可见所有处理组MMP下降(P<0.05或P<0.01)；⑥TCEP处理L02细胞24h和48h,仅200.00mg/L处理组胞内ATP水平降低(P<0.05)。TCEP处理HepG2细胞24h,50.00mg/L和200.00mg/L处理组胞内ATP水平降低(P<0.05),但在48h各处理组未见胞内ATP水平的变化(P>0.05);⑥TCEP处理L02细胞24h和48h,50.00mg/L和200.00mg/L TCEP处理组胞内游离Ca2+水平均升高(P<0.05, P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h和48h,在24h仅200.00mg/L TCEP处理胞内游离Ca2+水平升高(P<0.05),但在48h可见50.00mg/L和200.00mg/L TCEP处理组胞内游离Ca2+水平均升高(P<0.01);⑧TCEP处理L02和HepG2细胞24h,>3.12mg/L处理组SIRT1基因mRNA表达均上调(P<0.05或P<0.01),在48h所有处理组的SIRT1基因mRNA表达均上调(P<0.05或P<0.01)；⑨TCEP处理L02细胞24h和48h,所有处理组SIRT2基因mRNA表达下调(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h和48h,>3.12mg/L处理组SIRT2基因mRNA表达下调(P<0.05或P<0.01)；⑩TCEP处理L02细胞24h,所有处理组SIRT3基因mRNA表达均下调(P<0.05或P<0.01),在48h,>3.12mg/L处理组SIRT3基因mRNA表达均下调(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h,所有处理组SIRT3基因mRNA表达均下调(P<0.05或P<0.01),在48h,>3.12mg/L处理组SIRT3基因]mRNA表达均下调(P<0.05或P<0.01)；11TCEP处理L02细胞24h和48h,所有处理组SIRT1蛋白表达均上调,但是SIRT3蛋白表达均下调,不过仅在200mg/L TCEP处理组可见SIRT2蛋白表达下调。TCEP处理HepG2细胞24h和48h,所有处理组细胞SIRT1蛋白表达均上调,但SIRT3蛋白表达均下调,SIRT2蛋白表达变化不明显；12TCEP处理L02细胞24h,≥12.5mg/L处理组SIRT1蛋白表达均上调(P<0.05或P<0.01),在48h,所有处理组SIRT1蛋白表达均上调(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h和48h,所有处理组SIRT1蛋白表达均上调(P<0.05或P<0.01);13TCEP处理L02细胞24h和48h,≥12.50mg/L处理组mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均下调。TCEP处理HepG2细胞24h和48h,所有处理组mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均下调；14TCEP处理L02细胞24h,≥50.00mg/L处理组的细胞增殖受抑制(P<0.05或P<0.01),在48h,≥12.50mg/L处理组细胞增殖均受抑制(P<0.05或P<0.01)。TCEP与EX-527共处理L02细胞24h和48h,所有处理组的细胞增殖均受抑制(P<0.01)。TCEP处理HepG2细胞24h,≥12.50mg/L处理组细胞增殖均受抑制(P<0.05或P<0.01),在48h仅200.00mg/L处理组细胞增殖受抑制(P<0.05)。TCEP与EX-527共处理HepG2细胞24h,≥12.50mg/L处理组细胞增殖均受抑制(P<0.05或P<0.01),在48h,所有处理组细胞增殖均受抑制(P<0.05或P<0.01);15TCEP和EX-527共处理L02细胞24h和48h,所有处理组mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均下调。TCEP和EX-527共处理HepG2细胞24h和48h,所有处理组mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均下调。结论：TCEP致肝细胞线粒体损伤及线粒体功能紊乱,消弱SIRT1非依赖性PI3K/Akt/mTOR信号通路,最终导致肝细胞生长阻滞。第三部分TCEP激活p53非依赖p21/Rb通路致细胞衰老样生长阻滞的调控机制目的：研究TCEP致肝细胞衰老及其p53-p21-Rb信号通路的调控机制。方法：用RNA干扰技术沉默L02细胞中p53蛋白表达,建立L02-p53细胞模型。用TCEP (3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L)和DMSO(终浓度<0.1%,溶剂对照)分别处理L02细胞、L02-p53细胞和Hep3B(p53缺失细胞株)细胞24h和48h,对比性研究衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)阳性细胞率,IL-6分泌水平,以及p53、 MDM2、Rb、p-Rb、Ras、p2、IL6R、p38MAPK、p-p38MAPK、NFkB和p-NFkB蛋白表达。结果：①TCEP处理L02细胞24h和48h,所有处理组的SA-β-Gal阳性细胞率升高(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理L02-p53细胞24h,≥12.50mg/L处理组SA-β-Gal阳性细胞率均升高(P<0.05或P<0.01),在48h所有处理组SA-β-Gal阳性细胞率均升高(P<0.01),阴性对照组与溶剂对照组相比无显著性差异。TCEP处理Hep3B细胞24h和48h,所有处理组的SA-β-Gal阳性细胞率均升高(P<0.05或P<0.01)；②TCEP处理L02细胞24h,≥12.50mg/L处理组IL-6水平均降低(P<0.05或P<0.01),在48h,>50.00mg/L处理组IL-6水平均降低(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理L02p53-细胞24h,≥12.50mg/L处理组的IL-6水平均降低(P<0.05或P<0.01),在48h,≥50.00mg/L处理组IL-6水平均降低(P<0.05或P<0.01)。TCEP处理Hep3B细胞24h和48h,≥12.50mg/L处理组IL-6水平均降低(P<0.05或P<0.01)：③TCEP处理L02细胞24h和48h,所有处理组MDM2蛋白的表达均上调,p53蛋白表达均下调；≥50.00mg/L处理组p38MAPK、p-p38MAPK、NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表达均下调；所有处理组Rb和p-Rb蛋白表达上调；≥12.50mg/L处理组p21蛋白表达均上调。TCEP处理L02-p53细胞24h和48h,≥12.50mg/L处理组p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达均下调,≥50.00mg/L处理组NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表达均下调;所有处理组的Rb、p-Rb和p21蛋白表达均上调。TCEP处理Hep3B细胞24h和48h,≥12.50mg/L处理组p38MAPK、p-p38MAPK和IL6R蛋白表达均下调；所有处理组NFκB和P-NFκB蛋白表达均下调,Rb、p-Rb和p21蛋白表达均上调。结论：TCEP诱导肝细胞衰老样生长阻滞可能由p53非依赖性p21/Rb信号通路调控。但未见IL-6/IL6R和p38MAPK/NFκB信号通路参与TCEP诱导肝细胞衰老样生长阻滞。