【摘 要】
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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最为普遍、最为成功的微生物杀虫剂之一,但由于易被紫外线(UV)、高温、干旱等环境因素影响,导致其田间施用时的持效期相对较短,限制了其进一步发展。细菌生物被膜(bacterial biofilm,BBF)是细菌在生长过程中的一种保护性生长方式,可以提高细菌对UV的抗性,增强细菌对不良环境的适应能力,这一特性为突破细菌杀虫剂
【基金项目】
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国家重点研发计划“活体生物农药增效及有害生物生态调控机制”(No.2017YFD0200400); 国家自然科学基金项目“基于比较蛋白质基因组学解析生物被膜调控网络和交联对苏云金杆菌生防活性的作用机制”(No.31672084); 福建农林大学科技创新专项基金(CXZX2017266、CXZX2017214、103/KF2015063-065)
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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最为普遍、最为成功的微生物杀虫剂之一,但由于易被紫外线(UV)、高温、干旱等环境因素影响,导致其田间施用时的持效期相对较短,限制了其进一步发展。细菌生物被膜(bacterial biofilm,BBF)是细菌在生长过程中的一种保护性生长方式,可以提高细菌对UV的抗性,增强细菌对不良环境的适应能力,这一特性为突破细菌杀虫剂田间持效期较短等瓶颈提供了新的解决思路。为此,本文基于组学技术解析了苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)生物被膜形成和解离的重要调控蛋白和基因,有助于研制田间持效期更长的Bt制剂。主要研究成果如下:(1)首先通过SYTO9/PI荧光染料对Bt XL6生物被膜进行染色,利用激光共聚焦显微镜进行生物被膜定量实验,观察生物被膜的形成和解离过程以及该过程中不同时期的生物被膜的结构特征。结果显示,Bt XL6培养18 h后,细菌仍处于游离状态,20 h后聚集形成微菌落,处于被膜形成初期,随着培养时间增加,生物被膜厚度和生物量不断增长。培养34 h时,被膜生物量达到最大,被膜厚度最高,到达成熟期。56 h后,被膜的厚度呈降低趋势,被膜开始解离。(2)通过比较蛋白质组学,本文研究了 Bt XL6浮游菌体与生物被膜不同状态下全菌蛋白的表达差异。结果表明,生物被膜状态下的全菌蛋白中,在34 h和18 h之间,885个蛋白质显示出显著差异(比值≥1.5倍,p值<0.05),其中517个上调,368个下调;在20 h至18 h之间,344种蛋白上调,26种蛋白下调;在56h至18h之间,702种蛋白上调,438种蛋白下调;在20h至34h之间,423种蛋白质上调,433种蛋白质下调;在56h至20h之间,619种蛋白上调,552种蛋白下调;在56h和34h之间,581种蛋白上调,373种蛋白上调。(3)通过比较转录组学,本文研究了上述Bt XL6浮游菌体与生物被膜不同状态下基因转录水平的差异。结果表明,20 hVS 18 h无显著差异;34 hVS 18 h比较组中335个上调表达基因,196个下调表达基因;34 h VS 20 h 比较组中92个基因上调,69个基因下调;56 h VS 18h 比较组中,695个基因上调,462个基因下调;56 hVS 20 h 比较组中检测到287个上调基因,260个下调基因;56 h VS 34 h中,上调基因13个,下调基因8个。(4)进一步通过蛋白质组学与转录组学的联合分析,揭示了 Bt XL6生物被膜形成过程中发挥重要作用的关键蛋白和基因,选取部分基因进行了 RT-qPCR验证。结果显示,20h VS 18 h无上调、下调基因;34hVS 18 h有36个基因上调,6个基因下调;56 hVS 18 h有49个基因上调,14个基因下调;34hVS 20 h有2个基因上调,6个基因下调;56 h VS 20 h有24个基因上调,13个基因上调;56hVS 34h有1个基因上调。RT-qPCR验证结果与联合分析结果相符。联合分析使各时期差异蛋白/基因数量急剧下降,极大方便了后续重要调控功能基因研究。(5)本研究首次将转录组学,蛋白质组学联合分析,并参考已经成功解析的生物被膜调控网络初步构建了 Bt XL6生物被膜的调控途径和交联网络,从而初步揭示Bt XL6强生物被膜形成机制。根据文献检索,本文还新发现6个与Bt XL6生物被膜形成、解离有关的关键蛋白和基因,为下一步基于合成生物学构建工程生物被膜奠定了坚实的基础。
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