目的结直肠癌是人类常见恶性肿瘤之一,居恶性肿瘤死亡原因的第二位,近年来发病率呈明显上升趋势。常规MR扫描具有良好的软组织分辨率,能多方位、多平面成像,可以较好的显示直肠癌的肿瘤形态,可以判断对直肠周围的侵犯情况及有否转移,但不能评价器官功能的改变以及病灶内氧代谢水平的情况。磁共振血氧水平依赖成像(BOLD)成像的作用不同于常规MR扫描,通过T2*和R2*的变化,可以对病灶的氧代谢情况做出定量、半定量的分析,由此反映肿瘤的氧代谢水平,帮助判断放化疗敏感性,从病变形态学的观察过度到微观的代谢和功能状态分析,在病变的诊断、临床分期及疗效的预测和评价方面均可发挥作用。随着MR技术的发展,使得BOLD成像更快捷,时间分辨率更高,BOLD成像技术已广泛应用于头部,在腹部多用于肾脏,本研究在国内初次将其应用于直肠癌。恶性肿瘤的生长、转移和播散离不开自身血供的建立,这个过程的建立与微血管密度增加有关,侵袭、转移是恶性肿瘤最重要也是最本质的生物学特征,是恶性肿瘤患者死亡的主要原因,直肠癌也不例外,基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)可通过对细胞外基质降解,促进癌细胞对周围组织浸润和转移的发生,在肿瘤侵袭和转移过程中起关键作用。本实验就结直肠癌BOLD MRI,成像参数R2*与MMP-2和MVD计数相互间的相关性进行研究,从而为应用BOLD成像预测直肠癌血管生成及其侵袭转移能力提供依据。材料与方法1、临床资料2009年6月～2009年12月在中国医科大学附属第一医院就诊,临床诊断直肠癌的63例患者行磁共振平扫及BOLD成像。术前患者均未进行放化疗,在检查后2周内经手术证实为直肠腺癌,将获取了肿瘤大体标本及完整病理报告的51例纳入本研究。男性29例,女性22例。年龄35～83岁,平均60.7±10.4岁。肿瘤位于直肠上段12例,直肠中段23例、直肠下段16例。51例直肠腺癌中高分化12例,中分化31例,低分化8例。临床病理分期采用Dukes分期法,标准为：A期：癌肿侵犯粘膜或粘膜下层、浅肌层、深肌层；B期：侵犯直肠壁外；C期：淋巴结转移；D期：远处转移或腹膜转移。本组51例中A期6例,B期15例,C期23例,D期7例。2、BOLD成像扫描方法、图像后处理及分析(1) BOLD成像扫描方法检查前6小时禁食,确保肠道清洁。检查前40min口服盐酸消旋山莨菪碱(Raceanisodamine Hydrochloride Injection, 10mg/ml,山西双鹤药业)20mg,部分充盈膀胱。扫描时自由呼吸,无需屏气。所用机型为GE SignaHDx3.0T磁共振扫描仪,8通道相控阵列表面线圈。患者仰卧于检查床上,直肠内灌注温水200～600ml(视患者耐受情况而定),先行盆部MR平扫,包括轴位、冠状位及矢状位T2WI及轴位T1WI。平扫后,选择病变最大层面做靶层面进行BOLD轴位及冠状位或矢状位扫描,各扫描两层,得到48幅图像。具体扫描参数见表1。(2)后处理及分析将BOLD图像传送到GE公司的AW4.4图像后处理工作站,采用预装的R2STAR软件自动生成BOLD图像,首先评价BOLD图像质量级别,以周围脂肪信号强度作为背景噪声,计算图像的信噪比,并对BOLD图像获得病灶的R2*值,计算观察者间及观察者内差异。ROI区域要选择明确的病灶实性部分,多点采集取平均值。3、病理标本处理及免疫组织化学方法病理学切片制备、染色及读片结果均在病理科老师指导下完成。(1)切片制作对所选病例的石蜡包埋组织行连续切片,切片厚4μm,连续切片4张,第一张切片行HE染色,其余3张用于免疫组化染色。(2)免疫组织化学实验方法免疫组织化学方法采用过氧化物酶标记的链霉素卵白素法(SP)染色。CD34、MMP-2单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。已知的阳性直肠癌切片作为阳性对照,阴性对照用PBS缓冲液代替一抗染色。(3)免疫组织化学结果判断微血管密度(microvascular density, MVD)计数：MVD定义为单位面积组织切片内CD34染色阳性的微血管细胞数。肿瘤内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表1条单独的微血管。先在低倍镜下(100×)浏览全片,找出微血管密度大的“热点”(hot spot)，换高倍镜(200×),每张切片记录5个“热点”,取其平均数作为该病例的MVD。MMP-2判定标准：阳性主要表现为显微镜下肿瘤细胞胞质、血管内皮、间质中出现棕、黄色颗粒或团块。判定标准：先用低倍镜(40x)全面观察切面,选定待测组织MMP-2染色最强处,然后在200倍镜下计数100个细胞,阳性染色细胞<10%为阴性(-)；10～25%为弱阳性(+)；26～50%为阳性(++)；>50%为强阳性(+++)。4、统计学处理所有数据用SPSS 13.0及Medcalc统计学软件包及分析处理。计量资料以均数±标准差表示。对于正态分布、方差齐性的计量资料,两组间比较采用t检验法或配对t检验法,多组间比较采用单因素方差分析的方法。对于偏态分布的计量资料或等级资料,采用非参数检验。参数间相关分析采用Pearson法或Spearman秩相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。1、本研究所获BOLD图像可以观察肿瘤形态,结合平扫图像确定病灶范围,图像信噪比(SNR)为25.37±3.41；经质量评分,图像均达到测量要求；BOLD图像及R2*与BOLD合成图可以测量肿瘤的R2*值。2、直肠癌BOLD成像的R2*和T2*在一定范围内波动。51例直肠癌R2*的波动范围为19.16～43.07Hz,平均值26.23±5.28 Hz；T2*的波动范围为24.98～52.81ms,平均值40.52±6.72ms。3、BOLD图像R2*值与MVD计数和MMP-2表达间的相关性分析：MVD在MMP-2表达阳性组与MMP-2表达阴性组间差异有统计学意义(P<0.05)；肿瘤实质区R2*值在DukesA期较其他期别低(P<0.05),在病理分化程度及淋巴结有无转移组间差异无统计学意义；肿瘤实质区R2*值与MVD计数呈正相关(P<0.05)；肿瘤实质区R2*值在各MMP-2表达强度组间差异无统计学意义。结论1、直肠癌BOLD成像图像质量较高,可以准确测量病灶R2*值。2、BOLD成像可以反映病灶氧代谢水平,间接反映血流灌注特点,这为进一步研究肿瘤血管生成,找出肿瘤R2*值与微血管密度及免疫组化指标MMP-2间的相关性,评价肿瘤侵袭转移能力奠定基础。3、肿瘤实质区R2*值与MVD表达呈弱相关性,R2*值能反映直肠癌微血管生成情况,R2*值可能作为一种活体评价肿瘤微血管生成及侵袭能力的指标。