大豆GmGBP1基因参与光周期开花途径和逆境反应的功能分析

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大豆是一种重要的粮食作物和油料作物,也是人类的主要食用蛋白和工业原料的来源。根据国家粮油信息中心统计,2012年我国大豆播种面积为675万公顷,较上年减少14.43%,大豆产量为1280万吨,较上年减少11.63%。2012年全年我国大豆进口量达到5838万吨左右,再创历史新高,较2011年的5263万吨增长10.92%,我国大豆对外依存度进一步提升。而2011年,中国大豆产量为1449万吨,对外依存度高达78.4%。我国大豆竞争力不强与我国大豆品质差、持续生产力不稳、单产低密切相关。广适性、逆境胁迫等因素一直是困扰我国大豆生产的主要问题。大豆的生长发育多数对光周期反应是非常敏感的,这一特点严重影响了大豆品种的跨区种植以及适应性,进而影响大豆的产量。生物和非生物逆境是影响植物生长发育的重要限制性因素。高温、低温、干旱和盐碱等非生物逆境胁迫严重影响作物的生长,造成作物的大幅度减产,亚洲地区每年由于非生物逆境造成大豆减产30~50%,严重影响了大豆的产量和品质,威胁着大豆生产。因此,如果要从根本上解决我国大豆生产力低下的被动局面,关键的是要打破大豆生长区域的限制,即改变大豆对光的敏感性,提高大豆品种的适应性,扩大单一大豆品种的种植范围,使大豆品种在不同区域都可以正常的开花、成熟,同时增强大豆对逆境的抗性,改善大豆对环境的适应性,以期扩大大豆的种植面积,使大豆在不同环境下都能高产、稳产。SKIP是真核生物中的转录共激活子,在转录和剪切中发挥保守的共激活的作用,所有的已发现的SKIP同源蛋白均包含具有S-N-W-K-N信号肽的SNW/SKIP的结构域。对拟南芥和水稻中的SKIP的研究发现,SKIP的表达受多种激素与逆境胁迫的诱导,在植物的高盐和干旱胁迫中起着积极的调节作用,SKIP能够调节细胞活力,维持植物的正常的生长发育,SKIP还参与植物成花诱导,调控植物的开花时间。为获得具有光周期敏感性降低、抗逆性增强等复合优良性状的大豆基因,本研究利用Real-time RT-PCR方法分析了大豆SKIP同源基因GmGBP1的时空表达模式,及不同日长处理、胁迫和外源激素处理下GmGBP1的表达模式,利用酵母双杂交分析了GmGBP1与GmGAMYB1的蛋白互作情况,通过GmGBP1在模式植物拟南芥以及拟南芥突变体中过量表达,以及利用RNAi方法对拟南芥内源SKIP基因进行沉默,对转基因后代的表型和生理活动分析,了解大豆GmGBP1基因在植物中的基本功能,主要结果如下:1.大豆中SKIP基因有两个拷贝,分别为位于16号染色体的GmGBP1和位于1号染色体的GmGBP2,GmGBP1和GmGBP2的氨基酸同源率高达96.73%。GmGBP1cDNA全序列为2253bp,无内含子,编码612个氨基酸,理论等电点(pI)8.69,估计分子量69098.8Da,为亲水性蛋白。GmGBP1蛋白在其190-350个氨基酸处编码一个SKIP/SNW结构域,该结构域包含S-N-W-K-N的信号肽。2. Real-time RT-PCR分析GmGBP1在大豆根、真叶、三出复叶、茎、花芽、豆荚、幼胚中均有表达,长日照下,GmGBP1在大豆的幼胚、茎和根中表达量较高;短日照下,GmGBP1在大豆的三出复叶、幼胚和花芽中表达量较高,且短日照下GmGBP1除茎外其他部位均比长日照下表达量提高。3. Real-time RT-PCR分析GmGBP1的表达受GA3和ABA的调控。用100μmol的GA3处理大豆,GmGBP1在2h时达到表达高峰,之后持续上调,受GA3的正调控;用100μmol的ABA处理大豆,GmGBP1在1h时达到表达高峰,之后相对稳定表达,受ABA正调控。4. Real-time RT-PCR分析GmGBP1的表达受逆境胁迫诱导。用8%的PEG6000模拟干旱处理大豆,GmGBP1在4h时达到表达高峰,呈正调控;用200mM NaCl处理大豆,GmGBP1在4h时达到表达高峰,之后持续上调,呈正调控;用42℃高温处理大豆,GmGBP1在0.5h和1h持续上调并在2h时达到高峰,之后持续上调,呈正调控。5.构建了GmGBP1原核表达载体pGEX-6p-GmGBP1,重组蛋白产物在包涵体中,大小为95kD。6.构建了GmGBP1缺失片段酵母表达载体pBD-GmGBP1,转化酵母细胞证实GmGBP1在其C端存在转录激活活性;构建GmGAMYB1缺失片段酵母表达载体pAD-GmGAMYB1,酵母双杂交证实GmGBP1的SKIP结构域与GmGAMYB1的N端蛋白互作。7.利用pCAMBIA3300-pBI121-GmGBP1载体转化拟南芥,经PPT筛选,PCR和RT-PCR检测获得3个纯合的GmGBP1过表达拟南芥T3代株系;利用pCAMBIA3300-pBI121-GmGBP1载体转化myb33拟南芥突变体,经PPT筛选,PCR和RT-PCR检测获得3个的纯合GmGBP1过表达myb33拟南芥突变体T3代株系;利用pJawoh18-GmGBP1载体转化拟南芥,经PPT筛选,PCR和RT-PCR检测获得3个纯合的atskip干涉拟南芥T3代株系。8.在长日照下,过表达GmGBP1拟南芥表现早花,过表达GmGBP1的myb33突变体拟南芥花期同野生型,atskip干涉拟南芥为晚花。RT-PCR结果表明,GmGBP1促进CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUS T (FT)表达从而促进开花,同时GmGBP1与MYB33结合上调LFY表达促进开花;短日照下,过表达GmGBP1拟南芥和过表达GmGBP1的myb33突变体拟南芥为晚花, atskip干涉拟南芥为早花,RT-PCR结果表明GmGBP1上调FLOWERING LOCUSC (FLC)的表达从而抑制开花。9. GA3处理转基因拟南芥,可以促进过表达GmGBP1拟南芥种子萌发,对atskip干涉拟南芥促进不明显;PAC处理转基因拟南芥,可以抑制过表达GmGBP1拟南芥种子萌发,对atskip干涉拟南芥抑制不明显;ABA处理转基因拟南芥,可以抑制过表达GmGBP1拟南芥和atskip干涉拟南芥种子萌发。10.利用NaCl、干旱、高温胁迫处理转基因拟南芥,经表型分析、MDA含量测定、SOD活力测定和Real-time RT-PCR分析检测GmGBP1过表达拟南芥和atskip干涉拟南芥的逆境胁迫抗性,结果表明,GmGBP1提高拟南芥对干旱和高温胁迫耐性,降低拟南芥对NaCl胁迫耐性。
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