万古霉素功能化磁珠非靶向分离结合滚环扩增特异性检测金黄色葡萄球菌的研究

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食品安全是全球性的热点问题,而食源性致病菌是导致食品安全问题频发的主要原因。目前检测食源性致病菌的金标准仍然以传统培养法为主,该方法耗时较长且操作繁复,影响结果判别的时效性,也与食源性致病菌的快速识别检测理念相悖,因此建立快速灵敏的致病菌检测技术具有重要意义。抗生素磁分离(Antibiotic magnetic separation,AMS)是一种简单快速的致病菌富集前处理手段,是将抗生素作为识别分子直接或间接的修饰在磁性粒子表面从而非靶向捕获细菌,并在外部磁场作用下富集分离,省去了细菌预增菌培养所需要的时间。此外,抗生素磁分离较免疫磁分离相比成本更低,性质更稳定,因而其在食源性致病菌检测中具有较好的应用前景。本研究选用万古霉素(Vancomycin,Van)修饰的纳米磁珠(Magnetic nanobeads,MBs)作为食源性致病菌分离富集前处理手段,结合滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)制备的DNA纳米花(DNA flowers,DNFs)或RCA单链产物,在不需要提取目的菌DNA模板的情况下,负载酶或荧光染料,实现对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的比色或荧光检测。各章节内容分述如下:第一章综述了抗生素磁分离技术作为分离富集前处理手段在致病菌检测中的应用。第二章建立了 Van-MBs结合DNFs信号放大比色法检测S.aureus。本研究采用牛血清蛋白(BSA)介导的万古霉素(Vancomycin,Van)功能化磁珠结合生物素化的免疫球蛋白G(Biotin-IgG)“夹心识别”S.aureus,随后利用IgG上的生物素:一方面通过生物素-亲和素系统(Biotin-avidin system,BAS),直接与链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶(Streptavidin-horseradish peroxidase,SA-HRP)结合,催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色,从而实现S.aureus的比色检测;另一方面将RCA反应获得的核酸单链产物与生物素修饰的探针2(Biotin-probe2)互补配对制得DNFs,将DNFs通过BAS系统连接在“夹心结构”上,DNFs表面可负载大量SA-HRP,高效催化TMB显色液显色,实现S.aureus的信号扩大比色检测。本研究进行了一系列优化、表征和特异性验证,在最优的实验参数条件下,Van-MBs结合普通比色法对磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered saline,PBS)及商品化果汁中加标的S.aureus的最低检测限为3.3 × 105 CFU/mL,Van-MBs-DNFs信号扩大比色法检测对PBS及果汁中的S.aureus 最低检测限为 3.3 × 103 CFU/mL。第三章建立了以Van-MBs结合RCA荧光染色法检测S.aureus。本研究采用Van功能化的磁性纳米粒子以及biotin-IgG“夹心识别”S.aureus,再利用BAS系统,将生物素修饰的RCA探针引入夹心结构,加入phi29 DNA聚合酶引发RCA反应,RCA反应产生的核酸单链使用核酸染料SYBR GREEN II进行染色,通过检测荧光信号的强度实现对S.aureus的检测。本研究对Van-MBs结合RCA荧光染色法进行了一系列的参数优化,并验证了该方法的特异性,在最优的实验参数条件下,本方法对PBS和商品化果汁加标样中的S.aureus的最低检测限均为 3.3 × 102 CFU/mL。
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