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基因组编辑技术是近几年兴起的一项能对基因组完成精确修饰的一种技术,在2012年被Science评为十大重要科学进展之一,在植物功能基因组学及分子设计育种上具有广阔的应用前景。U3和U6启动子能驱动sgDNA的转录,是CRISPR-Cas9系统中的重要元件之一,在番茄中至少有4个U3启动子和10个U6启动子,这些启动子是否都具有转录功能?所以从番茄中筛选出具有高效转录活性的启动子从而提高CRISPR-Cas9系统的特异性。目前关于番茄内源启动子驱动sgDNA实现基因编辑还未见报道,并且番茄内源启动子与外源启动子驱动sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑效率是否有所差异还不清楚。本研究开展了两方面的工作,一方面从番茄中克隆多个候选U3和U6启动子并进行功能鉴定,为构建番茄CRISPR/Cas9基因编辑系统提供高效的的启动子;另一方面将筛选出具有较高转录活性的启动子SlU6-2P4,构建以SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,并同时构建以拟南芥AtU6及AtU6-26为启动子的CRISPR/Cas9编辑载体,载体构建成功后质粒转化番茄原生质体来验证番茄内源启动子与外源启动子在CRISPR/Cas9系统的中的有效性和差异性。(1)从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P启动子,其长度分别是1157bp、1104 bp、1147 bp,再采用Transfer PCR方法分别对三个启动子进行两种长度的截短,共得到6个不同长度的启动子,其长度依次是489 bp、318 bp、450 bp、248 bp、457 bp和248 bp,并分别构建6个启动子驱动GUS融合植物表达载体,再利用农杆菌真空渗透转化法分别转染番茄叶片。对已克隆的SlU3和拟南芥AtU3启动子进行序列比对,发现番茄U3启动子中也含比较保守的两个元件,USE和TATA框;利用农杆菌真空渗透转化法分别转染番茄叶片,结果显示成功侵染后的番茄叶片均被染成蓝色,但颜色深浅存在差异。结果表明番茄6种SlU3启动子均能驱动报告基因GUS的表达,并且SlU3启动子截短后也具有转录活性。实验结果表明克隆的6种番茄SlU3启动子均能驱动报告基因GUS的表达,但其表达水平存在一定差异。这为构建番茄CRISPR-Cas9基因编辑载体提供更多高效的内源启动子。(2)从中蔬四号番茄品种中克隆了4种SlU6-2P、SlU6-3P、SlU6-4P、SlU6-9P启动子,长度分别为1347 bp、1385 bp、1258 bp、1253 bp,再采用Transfer PCR方法分别对四个启动子进行两种长度的截短,共得到8个不同长度的启动子,其长度分别是452 bp、202 bp、448 bp、206 bp、433 bp、190 bp、448 bp和218 bp,并分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS融合植物表达载体。本文对拟南芥和已克隆的4个U6启动子进行序列比对,发现番茄U6启动子与拟南芥AtU6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。再利用农杆菌真空渗透转化法分别转染番茄叶片,结果显示成功侵染后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8种SlU6启动子均能驱动报告基因GUS的表达。通过GUS染色结果筛选出在番茄叶片染色较深的SlU6-2P4::GUS,构建以SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,并同时构建以拟南芥AtU6及AtU6-26为启动子的CRISPR/Cas9编辑载体,载体构建成功后质粒转化番茄原生质体来验证及对比番茄内源启动子与外源启动子在CRISPR/Cas9系统的中的有效性。结果表明,番茄内源启动子SlU6-2P4及拟南芥AtU6启动子均能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。另外有趣的是,在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中,番茄U6启动子与拟南芥U6启动子在番茄基因组内的同一位点进行编辑的后的突变竟呈现出一致的结果。