胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,发病在所有颅内肿瘤约占40%,侵袭性高和预后差是胶质瘤的典型特征。高侵袭性会导致高复发率和高死亡率,因此迫切需要深入理解胶质瘤侵袭的分子机制,从而针对性地研究防治胶质瘤侵袭的药物和方法,改善患者的预后。Gab2是支架蛋白DOS/Gab家族的一个成员,这个家族还包含哺乳动物的Gab1～Gab4蛋白。Gab2包含N端的PH结构域,中间富含脯氨酸的PRD基元及含多个磷酸化酪氨酸残基的C端。Gab蛋白绝大多数是间接通过Grb2介导聚集于活化的受体。在各种刺激下,Gab2发生酪氨酸磷酸化产生数个锚定位点来介导与含有SH2结构域的蛋白如PI3K的p85亚基结合。Gab2与PI3K的p85亚基的结合在PI3K-Akt-mTOR信号通路中起重要作用。近来,一系列的研究显示Gab2与肿瘤细胞的迁移和侵袭有关。首先,Gab2被检测到在乳腺癌细胞系与原发肿瘤中高表达。在Her2/Neu介导的沉默Gab2的小鼠模型中Gab2缺乏的细胞迁移能力降低,小鼠乳腺癌发生的肺转移也减少,提示Gab2能促进乳腺癌的转移。其次,有研究发现卵巢癌组织中Gab2高表达,而且Gab2通过活化PI3K通路促进卵巢癌细胞的转移。另外Gab2也高表达于恶性黑色素瘤、胃癌、肺癌及急性髓性白血病。然而,到目前为止,Gab2蛋白在胶质瘤中的表达及Gab2是否影响胶质瘤细胞的迁移和侵袭尚不明确。本研究首次检测了Gab2在胶质瘤中的表达,探讨了Gab2在胶质瘤侵袭中的作用,结果提示Gab2在胶质瘤侵袭中有重要作用,可以作为判断胶质瘤预后的有效分子指标。方法1.组织标本163例福尔马林固定石蜡包埋的胶质瘤组织来源于1997年1月到2007年12月之间在潍坊医学院附属医院与潍坊市人民医院接受脑胶质瘤手术切除的患者,其中胶质瘤Ⅰ级(pilocytic astrocytoma)23例(14.1%),Ⅱ级48例(29.5%),Ⅲ级52例(31.9%),Ⅳ级40(24.5%)。所有标本经10%中性福尔马林液固定,常规脱水包埋,5um连续石蜡切片及HE染色,每例病理切片均经两位病理医师确诊。按国际抗癌联盟(UICC)制定的胶质瘤分期标准对患者的详细临床资料进行分析。2.免疫组织化学按照Santa Cruz公司所提供的操作步骤进行。切取5um厚的组织切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,柠檬酸缓冲液和微波加热进行抗原修复,过氧化氢孵育中和组织中的过氧化氢酶,滴加羊血清封闭,加一抗37℃孵育30min后置于4℃冰箱过夜。第二天加亲合素结合的二抗,ABC溶液孵育,DAB染色,苏木精复染细胞核,脱水、透明、干燥后封闭液封片,光学显微镜下观察。3.IHS评分法评分结果判断由两名经验丰富的病理学教授,对免疫组化切片结果判断评估。细胞质或者核内见淡黄色细颗粒显著高于背景颜色为阳性细胞。每张切片选取5个高倍视野观察结果。采用IHS评分法,分数可能范围0-12。IHS分值9-12为强阳性,5-8为中度阳性,1-4为弱阳性,0为阴性。0-4为低表达,5-12为高表达。4.免疫印迹实验组织／细胞蛋白提取：剪取适量组织并尽量剪碎,加入RIPA裂解液(含lmMDTT和蛋白酶抑制剂),4℃搅动裂解20min。细胞蛋白的提取则向生长铺满瓶底的培养瓶中加入1mL预冷的RIPA裂解液,冰上晃动20min。取得的蛋白裂解液13000RPM离心10min,测定上清蛋白浓度。加适量体积的上样缓冲液,煮沸变性。免疫印迹检测：蛋白溶液经SDS电泳、转膜,用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭2h, β-actin作为内参照,加一抗后4℃过夜。TBST洗膜5min×3次后,加二抗并置于水平摇床摇动2h。按上述方法洗膜后加ECL并曝光。以目的蛋白条带的灰度值与内参照蛋白条带的灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。实验重复3次。5.细胞培养与转染三种胶质瘤细胞U87、LN229和U251均在含10%FBS的RPMI1640培养基中,37℃,5%CO2培养箱培养。细胞达到60%-70%融合后按照Lipofectamine2000的产品使用说明书进行质粒转染操作。将对照小RNA干扰质粒与Gab2特异性小RNA干扰质粒(干扰序列#1:5’-GTGAGAACGATGAGAAATA-3’;#2:5’-GATGCAGGCCTGACCTTTA-3’)(购自Invitrogen公司)转染入细胞,通过RT-PCR、Western-blot验证干扰效率；使用含有终浓度为0.7ug/mL G418(新霉素)的培养基进行筛选。选择干扰效率高的稳定转染的单克隆细胞用于后续试验。6. RT-PCR用TransZol Up提细胞的总RNA,用AMV第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA,逆转录步骤按试剂说明书进行。以此cDNA链为模板在梯度PCR仪上扩增出目的产物。取5uL扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳,凝胶图像分析系统上拍照,并分析各条带灰度值,以P-actin为内参,每组重复做3次。7.伤口愈合实验将生长状态良好的各组细胞,用10uL枪头于培养孔中部划一条宽度相等的横行细胞刮除带,分别于12、18、24h后分别观察各组细胞迁移情况,经过不同的时间间隔,记录三个固定位置处划痕宽度的变化,即为细胞迁移距离。拍照。每组设三个复孔。8.细胞趋化运动实验各组细胞分别重悬于无血清的RPMI1640培养基中,将细胞悬液加入上层板中,细胞终浓度为5×105cell/mL。在趋化小室下层板中加入IGF-1(10ng/mL)。在上下层板之间加入一张孔径为8um的预先用fibronectin包被过的滤膜。细胞培养3h后,用棉签将滤膜上层细胞完全刮去,用HE染色滤膜下层细胞,显微镜下随机计数5个高倍视野的细胞数,计算平均每高倍视野的穿膜细胞数,计算趋化指数。9. F-actin聚合实验饥饿细胞3h后以IGF-1(10ng/mL)分别刺激细胞0S、15S、30S、1min、2min、5min,4%PFA固定10min。F-actin buffer洗后加入带有荧光的phalloidin(1:20)室温下避光孵育60min。F-actin buffer洗后每孔加入100%甲醇900uL萃取phalloidin,离心,取上清液于酶标仪读取数值。荧光信号进行标准化,计算F-actin的相对含量。10. Transwell小室基质胶侵袭实验在上、下层板之间加入一张孔径8um的预先用人工基质胶覆盖过的滤膜。将各组细胞加入Boyden小室上室。下室加入含IGF-1(10ng/mL)的细胞培养基。24h后擦去上室面的人工基底胶和细胞,甲醇固定后HE染色,观察拍照。显微镜下随机计数5个高倍视野的细胞数,计算平均每高倍视野的穿膜细胞数,t检验比较组间差异。11.酶联免疫吸附试验收集各组细胞的培养基并过滤后测定游离的MMP-2与MMP-9的含量。用酶联免疫吸附实验试剂盒测定培养基中MMP-2和MMP-9的表达水平,具体操作参照产品说明书。以全自动酶标仪测定每孔的光密度,每个样品均重复测定3次,平均值作为最终结果。12.裸鼠颅内种植瘤试验与HE染色Scr/U87及siGab2/U87细胞用不含小牛血清的RPMI1640培养基稀释至1×108/mL,鼠脑立体定位仪头架固定裸鼠头部后,以裸鼠头部顶枕区作为穿刺点注入5μl(5×105个瘤细胞)悬液,观察各组裸鼠生存期,并对种植瘤组织HE染色观察种植瘤的生长与侵袭情况。13.统计学分析应用SPSS17.0统计软件进行分析,定量资料均采用均数±标准差形式表；临床病理特征与Gab2表达的关系采用卡方检验;生存分析采用log-rank检验。两组间均数比较用独立样本t检验；三组及以上的定量资料采用One-Way ANOVA,满足方差齐性假设时,多重比较用LSD检验,不满足时采用Welch校正,多重比较用Dunnett T3检验；涉及两因素时,使用两因素析因分析主效应和交互效应。以a=0.05为检验水准。结果1.Gab2在脑胶质瘤中的表达升高胶质瘤组织与癌周正常组织中Gab2相对表达量的平均值分别为0.83±0.062和0.37±0.067,胶质瘤组织中Gab2表达显著增高,t=20.432,P=0.000。同时胶质瘤细胞系U87、LN229和U251中Gab2均高表达。Gab2高表达率在低级别胶质瘤与高级别胶质瘤中分别为36.8%和62.1%,有显著性差异,P=0.001。Gab2蛋白在不同病理级别的神经胶质瘤中的表达随着WHO的临床病理级别的增高亦有增高的趋势。2.Gab2的表达与胶质瘤患者预后的关系根据免疫组化的Gab2表达结果,方差分析显示Gab2表达水平与患者的WHO分级和生存时间显著相关,分别为X2=10.189,P=0.001与X2=8.710,P=0.003,而与性别、年龄无显著性相关。Log-rank生存分析发现Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤患者中Gab2的高表达水平与各级胶质瘤的低生存期显著相关,均为P<0.05。3.胶质瘤组织中Gab2的表达与pAkt的表达相关脑胶质瘤组织免疫组化染色结果显示Gab2高表达的胶质瘤组织中pAkt的高表达率为75%,而Gab2低表达的胶质瘤组织中pAkt的低表达率为63.3%,通过方差分析表明,Gab2的表达与pAkt的表达呈正相关x2=24.280,P=0.000；低级别胶质瘤(Ⅰ+Ⅱ)与高级别胶质瘤(Ⅲ+Ⅳ)之间pAkt的表达有显著性差异,X2=10.189,P=0.001。4.稳定转染的人胶质瘤U87,LN229和U251细胞的鉴定RT-PCR与免疫印迹结果显示siGab2/U87、siGab2/LN229及siGab2/U251细胞的Gab2mRNA及蛋白的表达分别比U87细胞以及对照细胞Scr/U87、 Scr/LN229及Scr/U251均显著降低,从而证明通过小RNA干扰得到了Gab2的表达被稳定抑制的siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2/U251细胞及Gab2表达与U87细胞比较无显著改变的对照组Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251细胞。5.降低Gab2的表达抑制了胶质瘤细胞的迁移能力伤口愈合实验结果显示对照组Scr/U87细胞与Gab2表达减少的siGab2/U87的迁移距离(um)分别为278.222±29.269和530.556±27.758,有显著性差异,t=18.766,P<0.001；同样,Scr/LN229与siGab2/LN229组细胞的迁移距离(um)分别为309.556±26.378与560.667±41.286,有显著性差异,t=15.376, P<0.001; Scr/U251与siGab2/U251组细胞的迁移距离(um)分别为409.889±25.487与593.333±33.982,有显著性差异,t=12.956,P<0.001。可见Gab2表达降低的细胞爬出划痕较少,迁移距离小,而对照组细胞迁移距离较大,部分区域接近完全融合。这个结果说明Gab2表达降低后细胞的迁移能力也随之减弱。6.降低Gab2的表达抑制了胶质瘤细胞的趋化能力应用趋化小室的趋化运动模型,在不同浓度的IGF-1诱导3h后,根据不同浓度下各组细胞的趋化能力确定最适IGF-1趋化因子浓度为10ng/mL。在最适趋化浓度下Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251细胞具有很强的趋化运动能力,可见较多细胞爬至滤膜下面；siGab2/U87、siGab2/LN229和：siGab2/U251细胞的趋化运动能力显著降低,Scr/U87与siGab2/U87、Scr/LN229与siGab2/LN229、Scr/U251与siGab2/U251细胞之间比较趋化能力有显著性差异,分别为t=8.147, P=0.001; t=4.448,P=0.011;t=3.517。这个结果说明Gab2表达降低后细胞的趋化能力也随之减弱。7.减少Gab2的表达降低了胶质瘤细胞的侵袭能力Transwell小室基质胶侵袭实验结果显示,以10ng/mL的IGF-1作为趋化因子诱导胶质瘤细胞穿透基质胶和滤膜,Gab2表达降低的siGab2/U87、 siGab2/LN229和siGab2/U251细胞穿透基质胶和滤膜的平均数目分别为20.750±4.113、27.500±6.455、25.000±7.165,而对照组Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251细胞穿透基质胶和滤膜的平均数目分别为40.750±6.850、45.500±7.853、43.250±4.992,两组细胞分别比较差异有统计学意义,siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2/U251细胞穿透基质胶和滤膜的数目显著减少,分别为t=5.007, P=0.002;t=3.541, P=0.012;t=4.180, P=0.006,说明Gab2表达降低后胶质瘤细胞的侵袭能力显著降低。8.降低Gab2表达减少了丝状肌动蛋白(F-actin)的聚合在Scr/U87细胞内,IGF-1刺激15Sec和60Sec时诱发了快速肌动蛋白聚合,siGab2/U87细胞内肌动蛋白在各时间点聚合显著减少,Scr/U87与siGab2/U87两组之间比较有显著性差异,(?)=29.819,P<0.001, Scr/U87细胞组F-actin的聚合显著高于siGab2/U87细胞组,说明Gab2在细胞骨架重组过程中起着非常重要的作用。9.Gab2调节cofilin与LIMK1/2的磷酸化应用Western blot方法对Scr/U87和siGab2/U87细胞IGF-1(10ng/mL)诱导下的cofilin及LIMK1/2磷酸化水平进行测定,发现IGF-1诱导下siGab2/U87细胞的总cofilin和LIMK1/2的蛋白水平与Scr/U87细胞比较在各时间点均未见显著改变,而磷酸化的p-cofilin与p-LIMK1/2在Scr/U87细胞随着IGF-1刺激时间的延长而增多。siGab2/U87细胞随着IGF-1刺激时间的延长磷酸化的p-cofilin与p-LIMK1/2表达未见显著改变。][GF-1(10ng/mL)诱导后Scr/U87与siGab2/U87两组细胞之间p-cofilin与p-LIMK1/2表达量均有显著性差异,分别为F=11.781, P=0.005; F=24.206, P<0.001。10.Gab2的表达降低后胶质瘤细胞的MMP-2和MMP-9表达减少酶联免疫吸附试验测定细胞培养基中游离MMP-2和MMP-9的含量,结果表明在IGF-1(10ng/mL)诱导下,Gab2降低的siGab2/U87细胞培养液中MMP-2和MMP-9的相对含量分别为1.144±0.09和1.05±0.11,Scr/U87细胞的MMP-2和MMP-9含量分别为3.36±0.38和4.09±0.19,两组细胞之间比较有统计学意义,分别为F=72.853, P<0.001; F=321.272, P<0.001, siGab2/U87细胞培养液中MMP-2和MMP-9的相对含量显著降低；Western blot法测定各组细胞MMP-2和MMP-9的含量,IGF-1(10ng/mL)诱导后Gab2降低的siGab2/U87细胞中MMP-2和MMP-9的含量分别0.69±0.12和0.27±0.09,Scr/U87细胞的MMP-2和MMP-9含量分别为1.62±0.25和0.95±0.13, siGab2/U87细胞中MMP-2和MMP-9的含量均显著降低,与Scr/U87细胞比较有统计学意义,分别为F=5.840, P=0.004; F=1.706, P=0.002。11.降低Gab2的表达抑制Akt的磷酸化应用Western blot方法分析显示,Gab2降低的siGab2/U87细胞中IGF-1诱导的磷酸化pAkt水平与对照组Scr/U87细胞比较显著降低,两组细胞比较有统计学意义,F=72.100,P<0.001。本结果与胶质瘤组织中pAkt免疫组化表达结果相一致。12.降低Gab2的表达抑制mTOR的磷酸化Western blot实验发现Gab2降低的siGab2/U87细胞中IGF-1诱导的磷酸化的pmTOR水平与Scr/U87细胞比较显著降低,两组细胞比较有统计学意义,F=139.792,P<0.001,与siGab2/U87细胞中pAkt表达结果相符合,提示Gab2的信号转导与Akt和mTOR的磷酸化密切相关。13.荷瘤裸鼠的生存时间Scr/U87和siGab2/U87组裸鼠的中位生存时间分别为22.5天和26.5天,log-rank检验显示Gab2表达降低的siGab2/U87细胞组与对照Scr/U87细胞组比较生存时间显著延长,两组生存期的差别有统计学意义,x2=11.47,P=0.001。14.体内原位成瘤的侵袭性HE染色后Scr/U87组裸鼠种植瘤周围脑组织有较多肿瘤细胞浸润及卫星转移灶形成,平均为27.00±4.04个；siGab2/U87组脑组肿瘤病理切片显示裸鼠脑内肿瘤周围浸润的肿瘤细胞及卫星转移灶形成较少,巢状排列不明显,平均为12.13±2.75个。两组间比较差别有统计学意义,t=8.617,P<0.001。结论1.Gab2在胶质瘤组织中高表达,且其表达水平与胶质瘤的WHO临床病理分级及预后显著相关。2. pAkt的表达水平与胶质瘤的WHO临床病理分级及Gab2的表达水平显著相关。3.降低Gab2的表达后胶质瘤细胞的迁移能力、趋化能力与侵袭能力均显著下降,说明Gab2与胶质瘤细胞侵袭转移有关。4.Gab2通过调节丝状肌动蛋白(F-actin)的聚合在细胞骨架重组过程中起着非常重要的作用。5.Gab2通过调节调节cofilin与LIMK1/2的磷酸化而影响细胞肌动蛋白的聚合作用,从而调节细胞的迁移与趋化能力。6.降低Gab2表达减少了胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9的生成,从而减弱了胶质瘤细胞的侵袭能力。7.Gab2可以通过磷酸化Akt与mTOR,即通过调节PI3K-Akt-mTOR信号通路影响胶质瘤细胞的侵袭迁移能力。8.降低Gab2在胶质瘤细胞中的表达可以减少裸鼠种植胶质瘤向周围脑组织的侵袭,减慢胶质瘤的恶性进展,延长生存期。