背景1960年Jenning等首次明确提出缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的概念,此后,该问题成为医学工作者在心肌梗死治疗领域面临的严峻挑战。为减轻心肌IRI并缩小梗死面积,尽全力挽救心肌细胞,人们在临床和实验研究中采取了多种干预措施。1986年IRI领域出现了重大突破一缺血预处理(ischemic precondition, IPC),它是公认的IRI最有效的保护性干预措施。但由于缺血时间无法预测和受到伦理约束,使IPC在临床的应用受到限制。IPC的心肌保护机理尚未完全阐明,研究者们一直没有停止对IPC内在机制的研究,它对于临床更好地预防和治疗缺血/缺氧性心脏病具有重要意义。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是一种内源性细胞适应保护机制,适度的ERS能够激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)诱导细胞相关信号通路激活和应激蛋白表达增多,增强细胞对损伤的抵抗力和促进细胞生存；当应激原过强和应激持续时间过长时,内质网应激则倾向于诱导细胞凋亡。IRI和IPC均可激活ERS, ERS对心肌细胞的存活发挥了重大调节作用。IRE1-XBP1是UPR的一条重要信号通路,其开放状态决定了细胞的最终命运,XBP1是参与心肌IRI保护的重要转录因子。抑制miRNA-30c-2-3p表达能够通过升高XBP 1降低内质网应激细胞的凋亡率。miRNA-30c-2-3p和XBP1是否参与心肌IRI和IPC心肌保护机制目前尚无研究。microRNA作为一种新型内源性基因调节因子,参与了ERS的多条信号调节通路,在与心肌保护效应中的缺血、缺氧和心脏预处理也有明确关系。我们推测缺氧预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用在很大程度上是与调控内源性miRNA-30c-2-3p影响XBP1表达相关。那么通过改变心肌miRNA-30c-2-3p表达调控高转录活化因子XBP1的水平是否能够影响缺血/再灌注心肌的最终结局?鉴于此,我们设计了这个离体细胞实验,研究的目的在于明确miRNA-30c-2-3p和XBP1在缺血预处理产生心肌保护作用的地位,以及评价抑制内源性miRNA-30c-2-3p表达调控XBP1对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。该研究为探索有价值的心肌保护干预措施以及相关的药物开发提供重要实验依据。全部实验共分三个部分：第一部分：体外培养新生大鼠心肌细胞和建立离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型、缺氧预处理模型本部分的目的为确定成熟、稳定、纯度高和活性好的原代乳鼠心肌细胞体外培养方法,并采用厌氧培养法复合氮气构建离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型和缺氧预处理模型。采用比例为1：1的胰蛋白酶0.125%和I型胶原酶0.1%,在35℃下,通过混合多次消化分离1-3天龄SD乳鼠心肌细胞,70min差速贴壁并联合化学抑制剂5-BrdU纯化心肌细胞,通过倒置显微镜观察细胞活性,并采用心肌肌钙蛋白(cTnT) SABC-Cy3 (POD)免疫组化复合DAPI染色法鉴定细胞纯度。采用厌氧培养法复合氮气构建乳鼠离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。培养72h后的心肌细胞,随机分成7组：Sham组,即空白对照组,心肌细胞正常培养无需任何处理；1h组,心肌细胞进行缺氧1h；1h/6h组,心肌细胞进行缺氧1h后复氧6h；3h组,心肌细胞进行缺氧3h；3h/6h组,心肌细胞进行缺氧3h后复氧6h；6h组,心肌细胞进行缺氧6h；6h/6h组,心肌细胞进行缺氧6h后复氧6h。各组处理后,采用乳酸脱氢酶(LDH)毒性检测试剂盒检测各组心肌细胞LDH漏出率,AnnexinV/PI双染流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡情况。采用厌氧培养法复合氮气构建乳鼠离体心肌细胞缺氧预处理模型。心肌细胞培养72h后,随机分成6组：Sham组,即空白对照组,心肌细胞正常培养无需任何处理；AR组,心肌细胞仅进行缺氧3h复氧6h；15min*1组,心肌细胞进行缺氧15min复氧15min再进行缺氧3h/复氧6h(简称AR)；15min*2组,心肌细胞进行缺氧15min复氧15min两个循环后再进行AR; 30min*1组,心肌细胞进行缺氧30min复氧30min后进行AR; 30min*2组,心肌细胞进行缺氧30min复氧30min两个循环后再进行AR。处理后,采用乳酸脱氢酶(LDH)毒性检测试剂盒检测实验各组心肌细胞LDH漏出率,Annexin V/PI双染流式细胞凋亡术检测各组细胞凋亡情况。结果显示：倒置相差显微镜下,可观察到原代心肌细胞活性好,搏动有力,在培养48-72h后形成功能合胞体,出现同步化搏动。cTnT-SABC-CY3 (POD)免疫组化复合DAPI染色鉴定心肌细胞的纯度为(93.9±2.2)%。缺氧／复氧损伤模型构建中,与Sham组相比,1h组、1h/6h组、3h组、3h/6h组、6h组和6h/6h组LDH漏出率均明显增高,正常心肌细胞比例明显降低,凋亡细胞比例明显增高。与1h组相比,3h组和6h组LDH漏出率明显增高,正常细胞比例均明显降低,凋亡细胞比例明显增高。与3h组相比,3h/6h组和6h组LDH漏出率明显升高,正常心肌细胞比例明显下降,凋亡细胞比例明显升高。与6h组相比,6h/6h组心肌细胞LDH漏出率,正常细胞和凋亡细胞比例差异无显著统计学意义。缺氧预处理模型构建中,与Sham组相比,AR组、15min*1组、15min*2组、30min*1组和30mmin*2组LDH漏出率明显升高,正常心肌细胞比例明显下降,凋亡细胞比例明显升高。与30mmin*1组相比,AR组、15min*1组、15mmin*2组和30mmin*2组LDH漏出率明显增高,正常细胞比例显著下降,凋亡细胞明显增高。与AR组相比,15min*1组LDH漏出率,正常心肌细胞比例和凋亡细胞比例无显著统计学差异；15min*2组LDH漏出率发生明显降低,正常细胞比例发生明显升高,而凋亡细胞比例明显降低；30min*2组LDH漏出率明显升高,正常细胞比例下降,凋亡细胞比例明显升高。第二部分：XBP1和miRNA-30c-2-3p在心肌细胞缺氧预处理保护作用中的地位及miRNA-30c-2-3p对XBPl的靶向调控关系本部分实验的目的是明确XBP1和miRNA-30c-2-3p在心肌缺氧预处理保护作用中的地位,并确定miRNA-30c-2-3p和XBP1是否具有靶向调控关系。采用实时荧光定量PCR (realtime-PCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting)检测经缺氧3h复氧6h的缺氧／复氧损伤组(AR组)和经缺氧30min复氧30min再缺氧3h复氧6h的缺氧预处理组(APC组),分别在缺氧／损伤前、复氧1h、3h和6h时,XBP1、XBP1s蛋白和miRNA-30c-2-3p的表达量。使用携带miRNA-30c-2-3p反义寡核苷酸或无义寡核苷酸的不同浓度的慢病毒对培养48h的原代心肌细胞进行感染,确定病毒感染心肌细胞的最佳浓度。慢病毒感染后心肌细胞进行缺氧／复氧损伤并用realtime PCR检测缺氧／复氧前、复氧1h、3h和6h时miRNA-30c-2-3p, XBP1和XBP1s蛋白的表达量。构建构建野生型psiCHECKTM-2-XBPl-3’UTR-wt和突变型psiCHECKTM-2-XBP 1-3’UTR-mut报告基因载体,将miRNA-30c-2-3p mimics或NC mimics和这些报告基因载体或空载体(psiCHECKTM-2)转染H9c2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞。采用双荧光素酶基因报告试剂盒检测并分析各组荧光素酶活性。实验分成6组：①NC mi mics+psiCHECKTM-2组;②NC mimics+psiCHECKTM-2-Xbpl-3’UTR-wt组；③NCmimics+psiCHECKTM-2-Xbp1-3’UTR-mut组;④mo-miR-30c-2-3p mimics+psiCHE CKTM-2组;⑤mo-miR-30c-2-3p mimics+psiCHECKTM-2-Xbpl-3’UTR-wt组；⑥rno-miR-30c-2-3p mimics+psiCHECKTM-2-Xbpl-3’UTR-mut组。结果显示：相比于缺氧/复氧前,AR组在复氧1h、3h和6h后XBP1和miRNA-30c-2-3p基因表达水平和XBP1s蛋白均明显增高,且在复氧3h时达到顶峰。相比于AR组,APC组在复氧1h、3h和6h时,XBP1和XBP1s表达水平均明显增高,miRNA-30c-2-3p表达发生明显降低,且APC组中,XBP1和XBPls蛋白表达在复氧3h时达到峰值。荧光显微镜下观察携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒感染后的心肌细胞,随感染浓度增加,GFP阳性细胞数逐级增多,MOI为50时,GFP细胞阳性率>90%,与MOI为100时无统计学差异。选定病毒感染心肌细胞的最佳浓度为50MOI。感染携带miRNA-30c-2-3p inhibitor的慢病毒后,心肌细胞经缺氧/复氧损伤处理,相对于感染无义寡核苷酸序列的阴性对照组,AR前、复氧1h、3h和6h时,miRNA-30c-2-3p表达水平明显降低,而XBP1表达明显升高,XBP1s蛋白水平在复氧1h、3h和6h明显升高。与转染NC mimics+psiCHECKTM-2-Xbpl-3’UTR-wt组相比,miRNA-30c-2-3p mimics+psiCHECKTM-2-Xbpl-3’UTR-wt组荧光素酶活性明显降低,而miRNA-30c-2-3p mimics+psiCHECKTM-2-Xbpl-3’UTR-mut组荧光素酶活性无统计学差异。第三部分：miRNA-30c-2-3p调控XBPl对心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用及其机制的实验研究本部分实验的目的是探讨内源性miRNA-30c-2-3p调控XBP1对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制。进一步明确miRNA-30c-2-3p和XBP1在心肌细胞缺氧预处理心肌保护作用中的相互关系。将心肌细胞随机分成四组：空白对照组(Sham组),未经任何处理；缺氧/复氧损伤组(AR组),细胞经缺氧3h复氧6h处理；缺氧预处理组(APC组),经缺氧30min复氧30 mmin再缺氧3h复氧6h处理；慢病毒感染miRNA-30c-2-3p inhibitor组(INH组),细胞感染慢病毒miRNA-30c-2-3p inhibitor 48 h后,进行缺氧3h复氧6h。除INH外,其余三组均在处理前48h感染携带无义寡核苷酸序列慢病毒。采用乳酸脱氢酶(LDH)毒性检测试剂盒检测实验各组心肌细胞LDH漏出率,Annexin V-APC/7-AAD双染流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡情况,realtime-PCR检测miRNA-30c-2-3p和XBP1,蛋白质免疫印迹检测XBP1s和BiP蛋白表达量。结果显示：与Sham组相比,AR组、APC组和INH组LDH漏出率均发生明显增高,正常心肌细胞比例明显下降,凋亡细胞比例明显升高。与AR组相比,APC组和INH组LDH漏出率明显降低,正常心肌细胞比例明显升高,凋亡细胞比例显著下降。与APC组相比,INH组心肌细胞LDH漏出率明显增多,正常细胞比例下降,凋亡细胞比例升高。观察各组miRNA-30c-2-3p的表达,与Sham组相比,APC组和AR组miRNA-30c-2-3p表达均发生明显升高,INH组明显降低；与AR组相比,APC组和INH组miRNA-30c-2-3p的表达明显降低；与APC组相比,INH组miRNA-30c-2-3p表达发生明显下降。比较各实验组XBP1的表达,与Sham组相比,其余三组XBP1表达明显升高；与AR组相比,APC组和INH组XBP1表达明显升高；与APC组相比,INH组XBP1表达明显升高。观察各组XBP1s和BiP蛋白表达量,与Sham组相比,其余各组均发生明显增高；与AR组相比,APC和INH组XBP1s蛋白表达明显升高；与APC组相比,INH组XBP1s蛋白表达明显降低。各组BiP表达趋势与XBP1s一致,与Sham组相比,AR、APC和INH组BiP蛋白的表达明显升高；与AR组相比,APC组和INH组BiP蛋白表达明显升高；与APC组相比,INH组BiP表达发生明显下降。结论通过本实验,我们得出以下结论：1.采用厌氧培养复合氮气的方法,通过缺氧3h/复氧6h能够成功构建新生大鼠离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。通过缺氧30 min复氧30 min再进行缺氧3h/复氧6h能够成功建立乳鼠离体心肌细胞缺氧预处理模型,且缺氧预处理可对缺氧/复氧损伤心肌细胞产生明显的保护作用,减少心肌细胞凋亡。2.在心肌细胞内miRNA-30c-2-3p和XBP1具有靶向调控关系。低表达miRNA-30c-2-3p进而增加XBP1表达是缺氧预处理产生心肌保护作用的重要内在机制之一。3.通过抑制内源性miRNA-30c-2-3p可增加XBP1表达,对离体心肌细胞缺氧/复氧损伤产生明显的保护作用,降低细胞凋亡发生率。4.BiP表达可受到miRNA-30c-2-3p对XBP1调控作用的影响,BiP可能是XBP1产生心肌保护效应的下游因子。