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糖尿病脑病（diabetic encephalopathy,DE）是由糖尿病（diabetes mellitus,DM）引起的中枢神经系统损害,导致大脑神经发生功能和结构的改变,以获得性认知功能障碍和行为缺陷为特征。主要表现为记忆力减退、反应迟钝、注意力下降。其发病隐匿、进展缓慢,不易被及时诊断发现,是糖尿病并发症中较难防治的并发症之一,给家庭和社会带来沉重的负担。随着社会的老龄化和糖尿病患病率的增加,对糖尿病脑病的防治已成为众多研究者关注的重点问题。文献报道糖尿病脑病大鼠呈现阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）样病理改变,如神经元变性、海马萎缩、Aβ沉积和神经元纤维缠结等。流行病学研究也提示糖尿病将增加AD的患病风险,糖尿病是AD的独立风险因子之一。我们推测糖尿病脑病和AD存在某些相似的病理改变和发病机制。氧化应激（oxidative stress）损伤被认为是糖尿病和AD发病的重要机制。由于中枢神经系统（central nervous system,CNS）细胞膜由大量高度不饱和脂肪酸构成,对氧化应激损伤更加敏感。因此,氧化应激是糖尿病脑病和AD发病的早期事件,并且贯穿病程的始终。研究表明氧化应激可诱导一系列基因表达的失衡,参与机体的应激反应并在神经和精神系统疾病发病中发挥重要作用。微小RNA（micro RNA,miRNAs）是长度约为22个碱基的非编码小RNA,属于生物功能调节中的负向调控因子。miR-132是脑内含量最丰富的miRNAs之一,它在神经元的神经发生和可塑性中都发挥着关键作用。研究发现,miR-132在AD患者死亡后脑中显著下调,并伴有神经元死亡、淀粉样蛋白沉积等病理表现,提示miR-132可能参与AD的分子机制。本课题组的前期研究用H2O2刺激小鼠原代海马神经元制备氧化应激细胞模型,结合快速老化痴呆模型小鼠SAMP8和SAMP10,以及在AD患者外周血清中,采用芯片和q PCR技术筛选并验证了一系列氧化应激介导的与AD发病相关的miRNAs,其中miR-132表达显著下调,提示miR-132可能在AD中起作用。糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）是参与调控Tau蛋白异常过度磷酸化酶之一。研究证实,在AD发病机制中,miR-132模拟剂通过GSK-3β可以减少Tau蛋白在ser396和ser404位点的磷酸化,从而起到对AD的治疗作用。那么miR-132是否参与糖尿病脑病发病,其机制并不十分清楚,本研究旨在探讨miR-132是否通过介导GSK-3β/Tau通路参与糖尿病脑病的发病。第一部分miR-132在糖尿病脑病动物海马中的表达和意义目的:探究miR-132在糖尿病脑病动物海马中的表达情况。方法:1.选取40只8周龄体重在200g左右的雄性SD大鼠,用高脂饲料喂养28天。通过随机对照方法将40只大鼠分为两组,其中对照组大鼠10只,模型组大鼠30只。在大鼠禁食24 h后,给予模型组大鼠腹腔注射1%的STZ（40 mg/kg）,给予对照组大鼠腹腔注射生理盐水。72 h后,所有大鼠继续禁食24 h后尾静脉采血测空腹血糖。空腹血糖≥16.7 mmo1/L提示SD大鼠DM模型建立成功。造模28周后,利用Morris水迷宫实验对大鼠进行神经认知功能学测量,进而判定SD大鼠空间学习记忆能力,在DM大鼠中筛选出DE大鼠模型。之后分别将Con组、DM组及DE组大鼠麻醉后脱臼处死,提取DE大鼠海马组织中的微小RNA,按反转录说明操作进行反转录,之后利用实时荧光定量PCR法测定miR-132的表达水平。2.选取出生1 d的新生雄性SD大鼠,取海马组织按原代细胞培养操作步骤进行原代海马神经元细胞生命维持。制造不同浓度下的H2O2、高糖、甘露醇孵育原代海马神经元的细胞损伤模型。提取原代海马神经元细胞损伤模型中的微小RNA,按反转录说明操作进行反转录,之后利用实时荧光定量PCR法测定miR-132的表达水平。结果:1.DE组和DM组miR-132的表达明显降低,miR-132在DE组海马组织中的表达较DM组明显降低（P<0.01）。2.甘露醇、高葡萄糖和H2O2干预原代海马神经元组miR-132的表达水平与对照组相比均降低,但仅高葡萄糖和H2O2组与对照组相比具有统计学意义（P<0.01）。小结:在糖尿病脑病大鼠海马组织及原代海马神经元细胞氧化应激损伤模型中,miR-132表达水平减低,提示miR-132可能是糖尿病脑病发病过程中的保护性分子。第二部分miR-132介导GSK-3β/Tau信号通路参与糖尿病脑病的发生目的:探究miR-132是否通过调控GSK-3β/Tau通路,参与大鼠糖尿病脑病发病和HT-22细胞氧化应激损伤。方法:1.利用Western Blot技术检测DE模型海马中GSK-3β、p-GSK-3β（T216）、p-Tau（Ser404）和p-Tau（Ser396）蛋白的表达水平;Western Blot技术检测HT-22氧化应激损伤条件下GSK-3β的表达;Western Blot技术验证miR-132过表达对氧化应激条件下HT-22细胞中GSK-3β的表达情况。2.培养HT-22海马神经元细胞系,用不同浓度的H2O2、高糖和AGEs分别刺激HT-22细胞建立氧化应激细胞损伤模型,在体外模拟DE早期病变。3.实时荧光定量PCR技术检测miR-132在HT-22细胞中成功转染（过表达）。4.免疫荧光技术检测Con、DM和DE组GSK-3β和p-Tau（Ser404）的表达及共定位情况。5.免疫沉淀技术检测GSK-3β和p-Tau（Ser404）蛋白之间是否存在相互结合关系。6.免疫组织化学技术检测Con、DM和DE组GSK-3β、p-Tau（Ser404）和p-Tau（Ser396）的表达情况。结果:1.Western Blot结果显示,DM和DE组海马组织中GSK-3β、p-GSK-3β（T216）、p-Tau（Ser404）、和p-Tau（Ser396）的表达水平均高于对照组,且DE组较DM组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.体外模拟DE实验表明,H2O2、高糖和AGEs刺激后HT-22细胞中GSK-3β的蛋白表达水平升高。3.GSK-3β和p-Tau（Ser404）在糖尿病大鼠海马组织中表达水平上调（P<0.05）。4.免疫沉淀结果表明GSK-3β与p-Tau（Ser404）蛋白之间存在着相互结合关系,DE组结合程度较DM组和Con组之间相比显著增强。5.免疫组化结果显示,GSK-3β与p-Tau（Ser404）蛋白表达水平在Con、DM和DE组之间表达呈上调趋势。6.miR-132下调HT-22损伤细胞中GSK-3β的表达水平（P<0.05）。小结:1.miR-132通过介导GSK-3β/Tau信号通路参与大鼠糖尿病脑病的发生,可能是糖尿病脑病发病的分子机制之一。2.miR-132通过介导GSK-3β信号通路参与HT-22细胞的氧化应激损伤,可能是糖尿病脑病发病的分子机制之一。第三部分2型糖尿病脑病患者外周血miR-132和GSK-3β的水平变化及意义目的:探讨2型糖尿病脑病患者外周血的miR-132和GSK-3β的水平变化及意义,为2型糖尿病脑病的防治提供新思路。方法:1.选择2018年12月-2020年12月于河北医科大学第一医院内分泌科治疗的60例DE患者作为实验组,选择性别、年龄等一般人口统计学资料匹配的健康志愿者60名,作为健康受试组。2.分别收集DE组和健康受试组患者的各2管静脉血,每管5 m L,分别完成血清和血浆的分离。3.q RT-PCR检测DE患者外周血血清中miR-132的水平。4.酶联免疫吸附法检测DE组外周血血浆中GSK-3β的水平。结果:1.DE组患者外周血血清中miR-132水平明显下调（P<0.05）。2.DE组患者外周血血浆中GSK-3β相对水平明显上调（P<0.05）.小结:糖尿病脑病患者外周血的miR-132水平下调,GSK-3β水平上调,进一步验证了我们基础实验的研究结果,miR-132可能是糖尿病脑病发病机制过程中的保护性分子。