生物样本库是指标准化收集、处理、储存和应用健康及疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等样本以及与这些生物样本相关的临床信息、病理与检验信息、治疗过程与随访信息、知情同意等资料,以应用于疾病诊疗研究的信息管理与应用系统,包括样本实体库与信息库两方面的内容。作为融合了生物样本实体库、样本的关联信息及其实验数据的综合资源,生物样本库是基础研究与临床诊疗之间转化的桥梁,是转化医学研究的基础与保障。就实体库而言,保证质量是其关键。若在样本实体库建设之初未进行科学论证、采集、处理和保存疾病样本过于随意,可能导致入库样本在样本种类与数量、样本的处理与保存方式、样本及其抽提物的质量等方面存在隐患、不能满足未来的研究需要。因此,无论是院级生物样本实体库还是临床学科特设的生物样本实体库,均应考虑到如何规范化建设、科学管理样本实体库和建立完善的全流程质量控制体系,以便为转化医学研究打造高质量的资源平台。生物样本实体库的全流程质量控制体系中应考虑到源头质量控制和过程质量控制两部分。源头质控包括样本的采集过程规范、采集形式规范、信息留取规范及目标形式规范等,需在样本采集之前由临床医师与具有基础研究背景的样本库工作人员讨论确定;过程质控包括样本处理规范、样本存储规范、定期质量检测等多环节,需由样本库管理人员按照标准操作流程正确处理。本研究第一部分针对源头质控:首先针对不同的病种建立了与该病种相对应的“一病一卡”管理制度,进一步回顾性统计分析了该制度实施前、实施初期和实施成熟期三个阶段入库样本的疾病种类、病例数和样本数量等指标的变化趋势,进而探索该管理制度对样本库工作效率的影响。结果显示:通过具有基础研究背景的生物样本库管理者与临床医师的慎重讨论,根据不同病种的诊疗特点及未来的科研需求,在样本采集前先行制定《临床样本信息卡》,确定与该疾病对应的疾病样本的采集种类与数量、采集和运送的条件、抽提生物大分子的形式等,建立“一病一卡”管理制度规定特定病种的标准化采集流程,可以使样本种类更全面、数量更合理、其采集和运送过程更加科学化和标准化,从源头上保证了采集样本的质量、提高了生物样本库的工作效率。本研究第二部分针对过程质控:样本入库后其处理方式多样、质控涉及诸多环节,其中,使用RNAlater运输组织样本是一种常用的预处理方式,其对组织中的RNA保存效果较好,但其对蛋白和组织形态的影响尚有待明确。本研究评估了RNAlater对小鼠的肝脏、肾脏、睾丸、脑、结肠等五种组织的多种生物大分子及其形态的保存效果。研究发现,与新鲜组织及传统的液氮冻存方式相比,使用RNAlater预处理后再转入-80℃冰箱冻存,核酸(RNA和DNA)质量及组织形态变化均未见显著性差异,但其对不同种类组织中蛋白的保护存在差异性,RNAlater预处理的脑组织中蛋白成分发生显著降解,其余四种组织则未见组间差异。提示不同类别的组织样本需通过预实验明确保存效果后再进行大规模、标准化样本存储。通过本课题两部分的研究,从源头和过程两个阶段探索了生物样本实体库的质控管理,初步建立了生物样本实体库的全流程质控体系。通过该研究所获得的知识与技能有助于本人在将来从事临床工作的过程中全面地、科学地、前瞻性地获取高质量样本,为转化医学、精准医学的研究提供高质量的研究资源。第一部分:基于“一病一卡”管理制度的样本实体库源头质控体系的建立及应用【目的】针对不同临床科室采集样本的标准不统一、采集过程较随意,样本种类不全面与数量不合理、效率低下等问题,生物样本库管理者根据不同病种的诊疗特点及未来的科研需求,通过“一病一卡”管理制度规范各病种的采集流程、提高工作效率、从源头上保证样本质量;通过对该制度实施前后不同阶段样本库工作效率的变化进行回顾性总结分析,验证该制度实施后的效果以及在此基础上建立样本实体库源头质控体系的必要性。【方法】(1)制定病种特异的临床样本采集信息卡:临床医师与基础科研专家根据不同病种的诊疗特点及未来的科研需求,共同决定各病种需要采集的样本的种类与数量、采集方式及运送条件、抽提生物大分子的形式等,制定病种特异的《临床运送标本信息卡》。(2)建立并实施“一病一卡”管理制度:在信息卡的基础上制定标准化的工作流程,并培训临床医师及样本库管理人员严格执行标准流程。(3)统计分析不同阶段样本库工作效率的变化:回顾性统计不同时期在库样本的病种数、病例数及样本总数,总结“一病一卡”管理制度实施前、实施初期、实施成熟期三个阶段各项指标的变化趋势。(4)定期对在库样本进行质量抽检:对在库样本进行随机抽样,委托第三方质检单位进行质量检测并出具质检报告。【结果】(1)制定了各病种特异性的《临床运送标本信息卡》,规定了各种疾病需要采集的样本种类与数量、采集与运送方式等;并针对肿瘤、遗传、血液等特殊疾病添加了各自特色相关信息条目。(2)建立并实施了“一病一卡”管理制度,临床医师和样本库工作人员严格执行该制度所规定的工作流程,避免了样本种类收集不全面、样本数量收集不恰当、样本采集与运送条件不符合样本质控等现象。(3)自样本库启动至“一病一卡”管理制度实施前的1年时间内,仅入库6种疾病、60余例捐献者的200余份样本;“一病一卡”制度实施初期,各项指标均快速增长,2年内入库病种数快速增至近30种,病例数及样本总数达6,000余例、14,000余份;“一病一卡”制度实施成熟期,2年内入库病种数逐渐增至30余种,病例数及样本总数保持持续稳步上升状态,现已库存10,000余例、30,000余份样本。(4)第三方质检单位出具质检报告显示在库样本质量合格。【结论】“一病一卡”管理制度的建立与应用使生物样本的采集和运输过程更加规范化和标准化,有效提高了生物样本库的管理和工作效率,形成了有效的源头质控体系,从源头上保证了生物样本的质量。第二部分:过程质控体系中RNAlater对组织样本保存效果的评价研究【目的】组织样本采集后暂存于RNAlater、运送至样本库后再转移至-80℃冰箱是目前常用的一种工作流程,但RNAlater对组织中的蛋白质大分子及组织形态的保护作用尚无明确定论。本研究将通过生物大分子及形态学检测,评估组织保护剂RNAlater对哺乳动物多种组织的保存效果,指导实际工作中组织样本的正确保存,为高质量样本的获得提供理论基础。【方法】(1)采集小鼠的五种组织(肝脏、肾脏、睾丸、脑和结肠),每种组织各分为3组:○1新鲜组:新鲜组织采集后不做任何预处理(作为标准对照);○2RNAlater组:采集后浸没于RNAlater4℃过夜,弃去RNAlater液体后转移至-80℃冰箱保存;○3液氮组:采集后立即投入液氮速冻,10分钟后转移至液氮罐保存。(2)三组组织在同样的实验条件下进行生物大分子(RNA、DNA和蛋白质)抽提,以及福尔马林固定石蜡包埋后苏木素-伊红(HE)染色。(3)通过检测生物大分子的质量以及形态学改变间接衡量组织样本质量:检测核酸产量、纯度及完整性;检测蛋白表达量;光镜下观察组织切片HE染色结果。【结果】(1)经检测,RNAlater组的五种组织中都提取到了高质量的核酸,与新鲜组和液氮组相比,其产量、纯度和完整性均无统计学差异;此外,荧光定量PCR分析显示,五种组织m RNA的基因表达水平同样未见组间差异。(2)与新鲜组和液氮组的脑组织相比,RNAlater组的脑组织中蛋白成分发生显著降解,其余四种组织则未见组间差异。(3)HE染色结果提示五种组织均未发生显著的形态学改变。【结论】(1)RNAlater对多种组织的核酸大分子及组织形态都有很好的保存效果。当组织采集地点未配备液氮或超低温冰箱时,新鲜组织可以使用RNAlater暂存再转移至超低温冰箱,组织样本可保持高质量的核酸和形态。(2)RNAlater对组织中蛋白的保存效果存在组织差异性。针对不同类别的组织样本,建议先开展小规模预实验,明确RNAlater对其保存效果后再进行大量存储。