论文部分内容阅读
传粉是植物有性繁殖的重要阶段,也是作物种子产生的前提。在植物传粉过程中,落在柱头上的花粉萌发后,生长出花粉管穿过柱头和花柱,到达胚珠将精子释放到胚囊中,完成双受精过程。该过程包括多个重要的科学问题,但是人们对这些问题的了解较少,例如花粉管如何感知和响应来自于母本的导向信号从而准确生长到达胚珠等。为研究花粉管导向胚珠生长的分子调控机制,我们分离了一个拟南芥花粉管导向异常的转移DNA(T-DNA)插入的突变体,该突变体的T-DNA插入在AT5G14850的第五个内含子上,命名为abnormal pollen tube guidance1(aptg1)。aptg1/+杂合体自交后代只能得到杂合体和野生型,得不到纯合体,且杂合体和野生型的比例接近于1:1。互交实验中,当突变体做母本,野生型做父本时,有96.9%的突变位点能够传递给子代;当突变体做父本,野生型做母本时,突变位点传递效率明显降低,只有8.3%,说明突变的雄配子体功能异常。扫描电镜观察和亚历山大染色发现aptg1/+的花粉外形和活力与野生型相比没有明显差异。而且突变体的花粉体外萌发和花粉管生长正常。苯胺蓝染色和扫描电镜观察花粉管在雌蕊中的生长情况发现,当用aptg1/+花粉做父本,给野生型雌蕊授粉时,大约一半的花粉管在进入珠孔时显示出导向异常。这些导向异常的花粉管包括两种情况:一种是能够在胚珠表面或者珠柄附近生长,但是不能进入珠孔;另一种是花粉管在珠孔处缠绕生长,但是最终能够进入珠孔。这些结果表明aptg1花粉管在响应珠孔引导信号的过程中出现了问题。用限量授粉的方法使aptg1/+自交,授粉后3-4天大多数胚已经发育到心形胚,但是11.2%的胚停滞在球形胚或者之前的时期,表明aptg1纯合突变体的胚早期发育异常。qRT-PCR和GUS活性分析显示,APTG1在拟南芥的大部分组织中有表达,包括成熟的花粉、花粉管、成熟的胚囊和发育的胚,且APTG1在成熟花粉中比未成熟的花粉中表达量要高。荧光共标记实验表明APTG1定位在内质网上。系统进化和蛋白序列比对分析表明,APTG1与人(Homo sapiens)的PHOSPHATIDYLINOSITOL GLYCAN ANCHOR BIOSYNTHESIS B(PIG-B)和酵母(Saccharomyces cerevisiae)的GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOL10(GPI10)同源。PIG-B和GPI10是参与GPI锚(GPI anchor)合成的甘露糖基转移酶。APTG1的CDS序列能够互补酵母gpi10突变体温度敏感的表型,表明APTG1与酵母的GPI10是功能同源的,可能参与GPI锚的合成。COBRA-LIKE10是一个GPI锚定的(GPI-anchored)蛋白,定位在拟南芥花粉管的顶端质膜和细胞质区域,参与调节花粉管的生长和花粉管导向胚珠。aptg1突变的花粉管中,COBRA-LIKE10丧失在花粉管顶端质膜的定位,暗示APTG1参与的GPI锚合成对COBRA-LIKE10在花粉管的质膜定位中起重要作用。通过人工小RNA(artificial microRNA)技术,抑制APTG1在拟南芥植株中的表达,发现转基因株系幼苗的生长受到抑制,表明APTG1参与调控拟南芥的营养生长过程。综上所述,我们的结果显示拟南芥APTG1可能通过参与GPI锚定蛋白的加工,在花粉管导向胚珠生长以及幼苗生长、胚的发育中起重要作用。