猪附红细胞体病(Mycoplasma suis)是由猪附红细胞体引起的,以发热、贫血、黄疽等为主要临床症状的人畜共患病,能引起仔猪贫血、稽留热,育肥猪生长发育迟缓以及母猪不孕、流产等生理障碍,并可通过血液等多种方式传播,严重影响了畜牧业的发展和人类的健康。目前针对于猪附红细胞体病尚未研制出特效药物,所以尽早地检测和掌握猪附红细胞体的感染状况对该病的有效控制十分重要。为此,本试验建立了一种敏感、特异、安全和省时的猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法。首先根据GenBank上发布的猪附红细胞体OxaA膜蛋白基因序列设计一对常规引物,通过PCR扩增获得猪附红细胞体的目的基因片段(Ms232),并将其克隆至pMD18-T载体,构建pMD18-T-Ms232重组质粒,经质粒PCR和酶切鉴定后送往测序,完成目的基因的鉴定。参照常规引物序列,分别在上游和下游引物的5’端标记生物素(BIOT)和地高辛(DIG),合成一对标记引物,并在相同条件下,以此为引物进行PCR扩增,得到在两端分别带有以上2种标记物的目的基因片段。将该目的基因的PCR产物加入以链霉亲和素包被的酶标板中,目的基因通过其一端的生物素与链霉亲和素相结合固定于孔底。接着加入碱性磷酸酶(AKP)标记的抗地高辛抗体,使其与目的基因另一端的地高辛发生反应,最后加入相应的底物进行显色,并检测其OD405nm值。同时,通过标记方法改良、平台期摸索、方阵滴定等方法对PCR扩增、包被液浓度、封闭条件等环节进行优化,筛选出最优的条件。结果显示所设计的常规引物可准确扩增猪附红细胞体的目的基因片段,保证了标记引物的有效性。各项检测结果表明,所建立的PCR-ELISA检测方法的敏感度为0.36pg猪附红细胞体基因组DNA,比常规PCR高10倍,且不与猪链球菌、猪肺炎支原体、犬附红细胞体等基因组DNA发生交叉反应,具有较强的特异性。通过优化,该方法较传统PCR-ELISA法可节约近2h。对73份猪被检血液的阳性检出率为42.5%,高于常规PCR法的34.2%。本试验建立了一种敏感、特异、安全、省时的猪附红细胞体检测方法,为猪附红细胞体病的早期诊断和流行病学调查奠定了一定基础。