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磷脂酶A1是一类可以水解磷脂的酶类,在多种生物体内广泛存在,参与生物体内多种生理功能的调节。由于磷脂酶A1可以水解磷脂上的脂肪酸生成溶血性磷脂等特性,在食品加工、磷脂改造、油脂脱胶、制药等行业被广泛应用,拥有巨大的工业前景。目前从粘质沙雷氏菌扩增得到的磷脂酶A1基因在外源表达时可溶性表达量低,容易形成包涵体,并且抑制重组菌的生长,寻找合适的使磷脂酶A1可溶性表达量高并且对重组菌生长抑制小的表达系统对解决上述问题十分重要。本文主要进行了以下几个方面的研究：(1)从粘质沙雷氏菌p1-06基因组上扩增得到磷脂酶A1基因(plaA),连接至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS表达,实现了磷脂酶A1基因在大肠杆菌中的外源表达。通过对重组菌诱导条件优化,得到摇瓶培养最佳条件为：氨苄青霉素终浓度30μg/mL,IPTG加量0.25mmol/L,温度为34℃,OD600nm值为0.3,诱导时间4 h。在此条件下重组胞外磷脂酶A1酶活可高达8.6 U/mL,比优化前提高了43.3%。此外重组菌AP22生长抑制比AP22pLysS严重。说明用BL21(DE3)pLysS表达磷脂酶A1可以减轻生长抑制作用,但是测得胞外酶活却不高。(2)扩增得到磷脂酶A1+辅助蛋白基因(plaB),连接至表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)上,转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS上,实现了plaB基因在大肠杆菌中的外源表达。通过诱导条件优化与生长测定得知磷脂酶A1基因与辅助蛋白共表达时对生长抑制最严重,单独表达辅助蛋白时生长也受到抑制,说明辅助蛋白plaS可以抑制宿主菌的生长。(3)将磷脂酶A1基因(plaA)连接至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,转化至毕赤酵母KM71,实现了磷脂酶A1基因在毕赤酵母中的外源表达。通过优化得到摇瓶培养最佳条件为：甲醇浓度0.3%,温度为28℃,OD600nm值为60,PH 5.0。在此条件下重组胞外磷脂酶A1酶活可高达3.6U/mL,比优化前提高了56.5%。总之,选择大肠杆菌BL21(DE3)与载体pET-22b(+)一起表达磷脂酶A1基因(plaA)时可以提高磷脂酶A1胞外分泌表达量,而大肠杆菌BL21(DE3)pLysS能有效降低目的基因对宿主菌生长的抑制作用但是胞外酶活却不高。辅助蛋白PlaS的存在增加了重组菌生长的抑制作用。