琼玉膏通过sirt1/p53信号通路延缓H2O2诱导斑马鱼衰老的研究

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目的:通过建立H2O2诱导斑马鱼胚胎氧化损伤模型,用琼玉膏进行干预,对斑马鱼胚胎ROS生成、SOD、GSH-px进行分析,从斑马鱼的成活率以及ROS的生成结果判定琼玉膏对斑马鱼胚胎氧化损伤的影响;对斑马鱼胚胎衰老相关蛋白sirt1、p53、p21及其基因mRNA表达水平进行分析,比较正常斑马鱼胚胎组、H2O2诱导斑马鱼胚胎氧化损伤组以及不同浓度琼玉膏干预组之间衰老相关蛋白与基因表达的差异,探讨琼玉膏对抗斑马鱼氧化损伤通过sirt1/p53信号通路延缓衰老的分子机制。为琼玉膏抗衰老的可能分子机制提供试验参考和数据支持。方法:斑马鱼受精后4小时(4hpf),把斑马鱼胚胎分为A、B、C、D、E五组,A组为正常对照组,B组为0.5mMH2O2最终浓度孵育受精卵48h,C、D、E组分别H2O2诱导组采用生殖水制备的200,100,50ug/ml琼玉膏孵育1h,记录幼苗出壳发育率。分光光度法检测斑马鱼胚胎中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;SA-β-Gal染色分析。观察比较H2O2诱导斑马鱼胚胎氧化损伤衰老相关蛋白及其基因mRNA的表达水平:Western Blot检测Sirt1、p53、p21的蛋白表达水平;Real-Time PCR检测Sirt1、p53、p21基因mRNA的表达水平;使用SPSS19.0统计软件做统计学分析。免疫荧光法检测斑马鱼下丘脑sirt1的表达结果:1.与未处理的正常细胞(对照组)相比,H2O2诱导组显著降低了细胞存活能力。经过琼玉膏处理的的细胞(200,100和50μg/ml)细胞存活大量增加(p<0.05)。2.琼玉膏组在剂量依赖性下显著抑制了活性氧的生成,与H2O2诱导组反应的细胞相比,活性氧的生成量显著减少。3.琼玉膏组斑马鱼胚胎中的SOD和GSH-Px活性均显著提高(P<0.05),与正常组和H2O2诱导组比较,琼玉膏组中的SOD和GSH-Px含量均显著升高。4.与H2O2诱导组相比,斑马鱼β-半乳糖苷酶染色阳性率在琼玉膏50ug/ml浓度时无明显影响,在琼玉膏浓度为100ug/ml时染色阳性率下降,在琼玉膏200ug/ml浓度时能有效干预斑马鱼的衰老。5.Sirt1的蛋白及其基因mRNA表达水平在琼玉膏组明显增强,与正常组和H2O2诱导组比较有显著性差异(p<0.05)。6.p53的蛋白及其基因mRNA表达水平在琼玉膏组明显降低,与正常组和H2O2诱导组比较有显著性差异(p<0.05)。7.p21的蛋白及其基因mRNA表达水平在琼玉膏组明显降低,与正常组和H2O2诱导组比较有显著性差异(p<0.05)。8.琼玉膏对于细胞存活量、活性氧的产生与剂量存在一定依赖关系,200μg/ml琼玉膏干预组与H2O2诱导模型组比较细胞存活能力显著恢复(p<0.05),200μg/ml琼玉膏干预组与H2O2诱导模型组比较活性氧的产生显著降低(p<0.05)。9.免疫荧光法检测到斑马鱼下丘脑sirt1有清晰的绿色荧光信号,表明sirt1在斑马鱼下丘脑中阳性表达。结论:1.正常细胞(对照组)和H2O2诱导组细胞以及琼玉膏组处理的细胞存活有明显差异,说明琼玉膏能增加斑马鱼胚胎细胞的生存率并呈剂量依赖。2.琼玉膏的干预治疗对于斑马鱼胚胎氧化损伤有很强的氧化保护作用,能有效降低斑马鱼胚胎组织中细胞氧化损伤。3.Sirt1、p53、p21的蛋白及其基因mRNA表达水平在正常对照组和H2O2诱导组及琼玉膏干预组中有显著差异,p53、p21的蛋白及其基因mRNA表达水平在琼玉膏干预下呈现逐渐降低趋势。Sirt1蛋白及其基因mRNA表达水平在琼玉膏干预下呈现逐渐增强趋势。4.琼玉膏抗衰老的可能分子机制在于降低p53、p21的表达,增加sirt1的表达,从而调节sirt1/p53信号通路,降低细胞中活性氧的含量和增强对氧化损伤的保护作用。
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