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目的IL-35是一种新发现的属于IL-12细胞因子家族的异源二聚体。它含有EB病毒诱导的基因EBI3和IL-27 P35两个亚基。IL-35具有直接抑制T细胞增殖的免疫抑制的潜力,并且能够将T细胞转变为分泌IL-35的r IL35Treg细胞,正是由于IL-35如此强大的免疫抑制功能,并且已研究表明其不只是在T细胞中表达,在B细胞,巨噬细胞,肿瘤细胞中均有表达,那么,在机体任何疾病发生的原因必然与免疫微环境的失调有关,正常的免疫微环境需要促炎及免疫抑制因子的相平衡,任何一方的失调,即失平衡,必然引起疾病的发生,对于肿瘤来说,免疫微环境的改变不但可以成为其发生因素,在其发生之后,肿瘤细胞自身将会产生和分泌相关的细胞因子等来引起免疫微环境的进一步改变,于此之间的相互作用,必然引起肿瘤的进一步发生及发展。现已证实IL-35参与多种疾病的形成过程,包括各种炎症性疾病、冠状动脉疾病和癌症,在炎症性及免疫性相关疾病中,例如类风湿性关节炎,哮喘等均有相当多的研究报道,但是在肿瘤中对IL-35的研究还很少,我们在前期工作中研究发现IL-35在胰腺癌组织中及细胞系内均有高表达,因为胰腺癌是一个含有丰富间质成分的实体瘤,在其中炎性细胞占有很大比重,巨噬细胞是其中的主要细胞亚群,虽然IL-35与T细胞的相关性已经较为透彻,那么作为炎症细胞重要参与者的巨噬细胞,还没有过研究报道IL-35与之的相关性,本研究就在前期预实验中发现了IL-35的表达水平跟肿瘤中局部浸润的单核/巨噬细胞数具有相关性,并且已经有大量研究证实了巨噬细胞在肿瘤转移、进展和血管生成等过程中是一个重要的调节因子,因此本文为进一步明确IL-35招募单核/巨噬细胞的途径进行研究,将会对肿瘤的研究进展起到极大的推动作用,并且为临床的用药提供新的可能。内容和方法一、胰腺导管腺癌中IL-35的表达及与局部浸润单核巨噬细胞的关系1.在组织水平的免疫组化染色中,请病理科专业人员对片子的染色程度进行评分,评级,最后结果输入SPSS系统进行统计分析,得出IL-35的表达水平是否与局部浸润单核巨噬细胞数就有相关性,并且统计单核巨噬细胞数的水平与患者的预后是否相关。2.在癌症基因组数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)平台,分析IL-35与单核细胞相关Marker的相关性,进一步可以在胰腺癌组织的m RNA水平证实IL-35与单核巨噬细胞的相关性;二、探究IL-35招募单核/巨噬细胞的途径1.对过表达IL-35的稳转细胞系进行测序结果分析,查看IL-35的表达升高能够引起哪些与招募单核/巨噬细胞相关的趋化因子在基因水平的改变;2.在TCGA数据库平台进一步证实IL-35与单核/巨噬细胞相关的趋化因子是否具有潜在可能的相关性;3.利用q RT-PCR,Western-blot两个实验来验证,在细胞m RNA及蛋白水平上IL35是否与单核巨噬细胞相关趋化因子间存在潜在的关联性;4.如果IL-35与单核巨噬细胞相关的趋化因子间存在相关性,那么证实在机制水平上,IL-35能够调控相关趋化因子是必须的,因此,我们利用,IL-35重组蛋白的刺激,加入相关受体的阻断,观察趋化因子是否会跟随发生相关的改变,即Western-blot来验证IL-35促单核巨噬细胞相关趋化因子分泌的分子机制;5.为了确切得证实其相关性,那么需要证实在IL-35重组蛋白的刺激下,信号通路是否可以如何与趋化因子的启动序列区域的开放阅读框架相结合,因此用CHIP来验证IL-35是否能够和单核巨噬细胞相关趋化因子的启动子区相结合,是其之间的调控更加明确。三、体外功能实验来验证IL-35是通过相关趋化因子来对单核巨噬细胞产生的招募作用1.在机制上走得通,但是必须通过体外功能实验来进一步的确切,采用密度梯度离心法来分离得到外周血单个核细胞,再并用贴壁法对巨噬细胞进行纯化,进行得到相对纯化的巨噬细胞;2.用Transwel实验来验证稳转细胞系上清对单核巨噬细胞的招募作用,由于IL-35的改变引起下游趋化因子的改变,那么会分泌到细胞的培养上清中,用气来检测对巨噬细胞的招募能力,并且对结果中巨噬细胞的数量进行统计,再进行统计分析,查看有无统计学意义。四、体内动物实验来验证IL-35通过相关趋化因子对单核巨噬细胞的招募作用。1.小黑鼠皮下种植Pan02过表达及降表达IL-35稳转细胞系及选择性去除相关趋化因子及单核细胞组;2.密切观察小鼠肿瘤大小及小鼠状态的变化。结果一、1.免疫组化的结果显示,在组织水平上IL-35的表达高低与局部浸润的单核巨噬细胞数具有明显的统计学意义,并且单核巨噬细胞的浸润程度与患者的预后密切相关,胰腺癌组织局部浸润的单核巨噬细胞数增多能够明显降低患者的总生存期;2.在TCGA数据库中的胰腺癌组织m RNA水平,用热图的形式分析IL-35两个亚基与单核巨噬细胞的相关指标之间的相关性,能够明显发现IL-35的两个亚基与CD11b,CD68,CCR2等单核细胞相关Marker具有很高相关性。二、构建了胰腺癌过表达IL-35稳转细胞系(PANC-1,Bx PC-3和Pan02)和降表达IL-35稳转细胞系(MIA-paca-2,CFPAC-1和Pan02),并送去测序公司进行基因测序。1.过表达IL-35稳转细胞系的测序结果表明在过表达IL-35后与对照组细胞相比其与趋化因子相关的基因(CCL20,CCL2,CCL5,CX3CX1)表达均明显提高;2.TCGA数据分析表明IL-35两个亚基与CCL2,CCL5两个趋化因子都具有很高的相关性;3.q RT-PCR,Western-blot在细胞水平从m RNA及蛋白两个方面证实IL-35与CCL2及CCL5的相关性,结果证实IL-35与CCL5的相关性较明显;4.Western-blot来验证IL-35促CCL5分泌的分子机制是JAK-STAT通路,主要是STAT1和STAT4激活,磷酸化为P-STAT1和P-STAT4入核进行调控;5.CHIP进一步验证在IL-35的刺激下,P-STAT1和P-STAT4能否入核与CCL5的启动子序列进行结合。三、1.采用密度梯度离心法从外周血中获得单个核细胞,进一步采用贴壁法对单个核细胞进行纯化,来获得相对较纯的单核细胞;2.用Transwell证实IL-35通过促进PDAC分泌CCL5来招募单核巨噬细胞,并将结果进行统计分析,统计结果有意义。四、动物的体内实验证实,IL-35的过表达能够明显促进肿瘤的生长,如果在过表达IL-35的基础上阻断CCL5或者去除单核巨噬细胞,则瘤体的体积明显缩小,流式检测IL-35能够明显提高肿瘤内浸润的经典单核巨噬细胞的数量,如果在过表达IL-35的基础上阻断了CCL5和去除单核巨噬细胞,则招募的经典单核巨噬细胞数明显下调。结论众所周知,巨噬细胞对于肿瘤的生长、侵袭及转移具有重要作用,因此研究如何阻断巨噬细胞被招募至肿瘤微环境局部将具有重要的研究价值,我们首先在组织水平IL-35的表达与局部浸润的巨噬细胞数密切相关,IL-35过表达的细胞系测序结果同样发现,进一步得就发现了IL-35与与CCL5的调控关系将有可能是对抗肿瘤治疗的重要进步。IL-35在胰腺癌中表达,并且能够促进胰腺癌分泌CCL5来招募单核巨噬细胞,这将为胰腺癌中间质严重的炎症及纤维化提供可靠的依据,IL-35在胰腺癌中过表达,那么它在胰腺癌的免疫为微环境中,具有哪些功能作用需要再进一步的研究。