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禽戊型肝炎病毒(Avian Hepatitis E virus,aHEV)被认为是导致鸡大肝大脾病的主要病原,临床症状包括肝脏肿大、脾脏肿大、产蛋性能下降、腹腔积液等,目前在全世界鸡群中广泛流行和存在。2016年以来,在我国多个鸡群中发生了以肝脏脾脏肿大和破裂等为主要表现的鸡大肝大脾病并在相关鸡群中鉴定到新基因型禽戊型肝炎病毒。目前,针对禽戊型肝炎病毒的检测方法缺失仍然是对其开展有效监测和实施防控的难点之一,在目前禽戊型肝炎病毒体外培养体系不稳定的情况下,建立灵敏、特异和稳定的核酸检测方法对于开展流行病学调查和实施检测淘汰至关重要。本研究建立了针对禽戊型肝炎病毒的RT-PCR结合核酸斑点杂交检测方法并对国内多个疑似病例开展了分子流行病学调查。本研究根据已发表的禽戊型肝炎病毒的ORF2基因核酸序列,设计了用于扩增ORF2基因的引物F-2357和R-2357,以禽戊型肝炎病毒河北分离株VaHEV-HB核酸为模板扩增了其ORF2基因,连接至pMD18-T载体上成功构建了aHEV-ORF2质粒并进一步进行了测序验证。依据VaHEV-HB和其它参考毒株ORF2基因序列设计了两对引物,其中引物F-P-HEV和R-P-HEV用于制备地高辛标记核酸探针,引物F-W-HEV和R-W-HEV用于对样品核酸进行初步的RT-PCR扩增,引物F-P-HEV和R-P-HEV所扩增核酸区域位于引物F-W-HEV和R-W-HEV所扩增核酸区域之内。以aHEV-ORF2质粒为模板,以引物F-P-HEV和R-P-HEV参照PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书合成了HEV-ORF2地高辛标记核酸探针,检测样品时首先以引物F-W-HEV和R-W-HEV对样品核酸进行RT-PCR扩增,扩增产物不以核酸电泳检测,而是直接点于尼龙膜上以合成的禽戊型肝炎病毒地高辛标记核酸探针进行核酸斑点杂交检测。结果表明,建立的方法灵敏度可达到10pg/μL,仅识别禽戊型肝炎病毒的核酸,对ALV-A、ALV-J、REV、CIAV、FAdV等病毒核酸不发生显色,具有高度的特异性。将所建立的方法与常规RT-PCR、套式RT-PCR进行灵敏度及检出率的对比,显示本方法的灵敏度与检出率远高于常规RT-PCR,并且比套式RT-PCR也可检测出更多禽戊型肝炎病毒阳性样品,为开展禽戊型肝炎病毒分子流行病学调查和临床诊断提供了一种敏感特异的检测方法。利用建立的RT-PCR结合核酸斑点杂交检测方法对河北、山东、北京、辽宁、广西等14个地区的15个养鸡场总计197份疑似病例进行了针对禽戊型肝炎病毒的检测,结果显示197份样品中有78份为禽戊型肝炎病毒阳性,阳性率为39.6%,不同鸡场禽戊型肝炎病毒阳性率在22.2%~69.2%之间不等。对所有阳性样品ORF2基因扩增产物进行了克隆测序并对其进行了同源性分析和遗传进化分析,结果表明,所得78个序列同源性在74.4%~100%之间,按照同源性高低大致可分为四组,每组序列同源性相近,但四组序列之间同源性存在一定差异。进化树分析发现阳性样品分别为禽戊型肝炎病毒基因3型、基因5型和其他未知基因型,其中以基因5型居多,基因型未呈现出明显的地域规律。本研究建立了针对禽戊型肝炎病毒的RT-PCR结合核酸斑点杂交检测方法,证实其具有较高的灵敏度和特异性,应用该方法对国内多个疑似病例开展了分子流行病学调查并对其ORF2基因进行了遗传进化分析,为了解禽戊型肝炎病毒在我国的流行动态和变异提供了新的参考数据。