早产胎膜早破(preterm premature rupture of membrance,PPROM)是引起早产的主要原因之一,占到早产的25%,约30-40%的早产与PPROM有关。其中在妊娠36周前的PPROM会出现妊娠期较为严重的并发症,其发病率近年来有增加趋势。早产胎膜早破作为占早产原因1／3的产科并发症,早预测早预防具有重大临床意义,能一定程度降低早产率,提高孕产妇及新生儿生存率。长期以来,胎膜早破是早产临产前的一种危机,早产常与胎膜早破合并存在,胎膜早破使早产成为不可避免,两者互为因果。因此,对PPROM高危因素的分析对其早预防早诊治显得尤为重要,具有一定临床意义。国内外大量研究显示基质金属蛋白酶(MMPs)是一族能降解细胞外基质中所有蛋白成分的内源性酶,对细胞外基质中相应成分的降解,可调控细胞外基质含量和胎膜结构,引起胎膜组织结构的弱化,从而导致胎膜早破发生。随着研究深入,对于早产胎膜早破的病因学研究已进入基因水平。研究发现由于母体与胎儿之间的MMPs基因多态性现象与PPROM有关,导致存在易感基因的孕妇发生PPROM的风险也就增加。易感基因的特点是基因的变异本身并不直接导致疾病的发生,而只造成机体患病的潜在危险性增加,一旦外界有害因素介入,即可导致疾病发生。不同群体和个体对疾病的易感性、抵抗性以及其他生物学性状有差别,其遗传学基础是人类基因组DNA序列的变异性,其中最常见的是SNP。近期有国外学者研究发现胎儿MMP家族的遗传变异中MMP-1、MMP-9、MMP-8转录启动子区域的某些基因多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与PPROM有关。但是,目前对于与PPROM发病机制相关的MMPs SNP筛查,以及其基因多态性结合母体因素共同研究分析其发病原因的研究不多,且仅限于其中某一种基因并且研究都是针对美洲及非裔美洲人种。对于亚洲人种(中国)这方面的研究暂未见报道。目的本研究将立足早产胎膜早破为契机,从分子及蛋白水平上研究PPROM与其胎膜组织上的基质金属蛋白酶表达量之间相关性并进行验证,同时在基因水平上进一步研究PPROM与基质金属蛋白酶基因多态性之间相关性,并结合PPROM相关高危因素共同分析三者相互关系,探讨基质金属蛋白酶基因多态性与母体因素共同作用对PPROM易感性影响,旨在为早期预测早期预防PPROM提供科研依据,提高母婴生存率及生存质量有重大临床意义。方法一、早产胎膜早破相关高危因素分析选择2009年5月至2010年1月,在广州、深圳市三甲(广州南方医科大学附属南方医院、广州医学院附属三院、深圳市妇婴医院、深圳市罗湖人民医院)及二甲医院(南方医科大学附属三院华瑞医院、广州武警总队医院番禺分院、深圳市西丽人民医院)住院分娩的早产胎膜早破的孕妇共78例,足月胎膜早破的孕妇107例,自发性早产的孕妇59例,各组均在同一时期按一定比例在各家医院抽取,同时随机抽取同时期入院分娩的正常足月产的孕妇171例。对每一位研究对象入院后进行病史询问,并记录孕妇年龄、体重、户籍情况、文化水平、职业、健康情况、系统产检与否。并询问是否既往早产或早产胎膜早破史、孕期阴道流血史、孕期生殖道炎症史、宫颈机能不全或宫颈管≤30mm、绒毛膜羊膜炎、吸烟或被动吸烟、羊水过多、双胎妊娠、人工流产次数、孕期羊膜腔穿刺术或胎儿镜检查、孕期额外补充维生素等。临床病史资料由各位孕妇管床医师协助完成询问并记录,并经过患者知情同意。原始病历资料统一输入EXCEL电子表格之后进行统计学分析。二、胎膜组织中MMPs (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9)表达差异的研究1、采集研究对象外周静脉血提取DNA,应用荧光定量PCR反应(SYBR Green法Real-time PCR)方法分析MMPs mRNA含量：荧光定量仪ABI 7500全自动荧光定量PCR仪检测反应结束后,由电脑自动分析并计算结果。结果按拷贝数分析,用B表示,即B=拷贝数／μl cDNA。考虑到各个样本总RNA浓度的差异,最终计算结果按下列公式换算：A=B1(目的基因)÷B2(内参基因)。2、采集研究对象胎膜组织提取RNA,应用Western-blot法分析胎膜组织上MMPs蛋白表达量：以GAPDH为内参,每组均相同条件重复3次,待膜干后对其进行扫描保存,图像处理系统分析显色条带灰度值以判断蛋白含量高低。各组MMPs在胎膜组织中均有不同程度表达并进一步验证了Real-time PCR法定量的结果。三、早产胎膜早破与基质金属蛋白酶基因多态性及母体因素关联性研究应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)检测MMPs (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9)的多个位点多态性之后,由各组质谱图的信号峰可看出MMPs各SNP位点中：MMP-8(rs1320632、rs2155052),MMP-9 (rs3918242)仅出现一个T基因型信号峰,未出现多态性表现,因此剔除。余下各位点分析其多态性即SNP基因型在病例对照组中的分布是否符合Hardy—Weinberg平衡并计算基因型、等位基因型分布频率及其结合母体因素分析与PPROM的关联性。四、统计学处理采用SPSS16.0进行统计学分析。计量资料统计学描述采用x±s,计数资料采用频数和百分比表示。计量资料两组组间差别比较采用成组t检验,若方差不齐采用Mann-Whitney U检验；多组组间差异比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,若方差不齐,采用Kruskal-Wallis H检验,组间两两比较采用Mann-Whitney U检验,多重检验校正采用Bonferroni校正。计数资料的组间差异比较采用χ2检验、两两比较采用分割χ2检验、单因素和多因素Logistic回归分析。采用陈大方,陈常中专著中SAS宏程序进行Hard-weinberg遗传平衡检验,并计算基因型、等位基因型分布频率。采用χ2检验、两两比较采用分割χ2检验、单因素和多因素Logistic回归分析进行组间基因型、等位基因分布差异检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果一、早产胎膜早破相关高危因素分析1、研究人群年龄,孕前体重指数及孕期增重情况：早产胎膜早破组年龄与各组年龄比较,足月胎膜早破组年龄大于早产胎膜早破组,两者之间差异有统计学意义(P=0.003)；早产胎膜早破组孕期增重小于正常足月产组,它们之间差异有统计学意义(P<0.001)。2、研究人群一般临床资料情况分析：早产胎膜早破组与足月胎膜早破组比较,绒毛膜羊膜炎在两组的分布情况的差异存在统计学意义(P=0.030)；早产胎膜早破组与正常足月产组比较,系统产检、既往早产或早产胎膜早破史、孕期阴道流血史、绒毛膜羊膜炎、吸烟或被动吸烟、双胎妊娠、体外受精胚胎移植术在两组分布情况的差异存在统计学意义。(P<0.05)。3、早产胎膜早破相关危险因素的单因素Logistic回归分析：以早产胎膜早破为病例组,以自发性早产组、足月胎膜早破组及正常足月产组为对照组,分析与早产胎膜早破有关联的高危因素。早产胎膜早破组与足月胎膜早破组比较,年龄是危险因素(OR=0.921,95%CI：0.872-0.973)；早产胎膜早破组与足月正常产组比较,与早产胎膜早破相关的保护因素有：孕期增重(OR=0.707,95%CI：0.623-0.803)、系统产检(OR=0.506,95%CI：0.294-0.871)、人工流产次数少于1次(OR=0.576,95%CI：0.334-0.994)；相关的危险因素有：既往早产或早产胎膜早破史(OR=9.189,95%CI:1.010-83.619)、孕期阴道流血史(OR=5.125,95%CI:1.978-13.280)、绒毛膜羊膜炎(OR=4.64,95%CI:1.951-11.060)、吸烟或被动吸烟(OR=2.174,95%CI：1.253-3.771)。二、胎膜组织中MMPs (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9)表达差异早产胎膜早破组与足月胎膜早破组相比较,MMP2, MMP7表达降低,MMP3, MMP8表达增高,且它们之间差异存在统计学意义(P<0.001), MMP1, MMP9表达无明显统计学差异；与自发性早产组比较,MMP2, MMP7表达增高,MMP8表达降低,且它们之间差异存在统计学意义(P<0.001), MMP1, MMP3, MMP9表达无明显统计学差异；而早产胎膜早破组与正常足月产组比较,MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP9表达增高,且它们之间差异存在统计学意义(P<0.001),MMP8表达无明显统计学差异。Western-blot进一步验证其蛋白表达量的差异：MMP-1在早产胎膜早破组、自发性早产组、足月胎膜早破组的表达高于正常足月产组；MMP-2在早产胎膜早破组、足月胎膜早破组的表达高于自发性早产组和正常足月产组,足月胎膜早破组的表达高于早产胎膜早破组；MMP-3在早产胎膜早破组、自发性早产组的表达高于足月胎膜早破组和正常足月产组；MMP-7在足月胎膜早破组的表达高于早产胎膜早破组、自发性早产组和正常足月产组；MMP-8在自发性早产组的表达高于早产胎膜早破组、足月胎膜早破组和正常足月产组；MMP-9在正常足月产组的表达低于自发性早产组、早产胎膜早破组和足月胎膜早破组。三、早产胎膜早破与基质金属蛋白酶基因多态性及母体因素关联性：1、Hardy—Weinberg平衡检验病例对照组基因型：本研究采用SAS9.1统计学软件对正常足月产组进行Hardy—Weinberg平衡检验,除MMP-2 (rs243866) MMP-8 (rs11225395)外(P=0.049,P=0.014),其余各MMPs-SNP位点基因型频率均通过平衡检验(P>0.05),说明本研究收集的样本基本具有一定人群的代表性,适合做候选易感基因研究。2、早产胎膜早破组与自发性早产组、足月胎膜早破组及足月正常产组等各对照组MMPs基因SNPs基因型分布频率、等位基因分布频率的比较(1)早产胎膜早破组与早产组、足月胎膜早破组及足月正常产组等各对照组MMPs基因型分布频率比较结果：早产胎膜早破组分别与足月胎膜早破组、自发性早产组及正常足月产组比较,早产胎膜早破组与足月胎膜早破组相比,MMP1 (rs1799750)、MMP3 (rs61781、rs35068180)各基因型分布频率存在差异具有统计学意义(P<0.01)；与自发性早产组相比,MMP2 (rs243865、rs243866、rs2285053、rs17859821)、MMP3 (rs35068180)各基因型分布频率存在差异具有统计学意义(P<0.01)；与正常足月产组相比,MMP1 (rs1799750)、MMP2 (rs2285053、rs17859821)、MMP3 (rs35068180)、MMP8 (rs11225395)各基因型分布频率存在差异具有统计学意义(P<0.01)。(2)早产胎膜早破组与自发性早产组、足月胎膜早破组及足月正常产组等各对照组MMPs等位基因分布频率比较结果：早产胎膜早破组分别与足月胎膜早破组、自发性早产组及正常足月产组比较,早产胎膜早破组与足月胎膜早破组相比,MMP3 (rs617819、rs35068180)、各等位基因分布频率存在差异,具有统计学意义(P<0.05)；与自发性早产组相比,MMP2 (rs243865、rs243866)、MMP3 (rs35068180)各等位基因分布频率存在差异,具有统计学意义(P<0.05)；与正常足月产组相比,MMP2 (rs2285052、rs2285053)、MMP3 (rs35068180)各等位基因分布频率存在差异具有统计学意义(P<0.01)。3、早产胎膜早破相关危险因素Logistic回归分析：Ⅰ、单因素分析：1、MMPs各基因型分布频率与早产胎膜早破关联性分析：早产胎膜早破组MMP1 (rs1799750) G.DEL基因型分布频率与GG基因型分布频率比较,G.DEL基因型分布频率高于正常足月产组,且差异有统计学意义,携带G.DEL基因型会增加早产胎膜早破的风险(OR=2.402,95%CI：1.336-4.320). MMP2(rs2285052)CA基因型分布频率与CC基因型分布频率比较,CA基因型分布频率低于正常足月产组,且差异有统计学意义,携带CA基因型降低早产胎膜早破的风险(OR=O.140,95%CI：0.032-0.606)。MMP2(rs2285053) CT基因型分布频率与CC基因型分布频率比较,CT基因型分布频率高于正常足月产组,且差异有统计学意义,携带CT基因型会增加早产胎膜早破的风险(OR=3.200,95%CI：1.828—5.603)。2、MMPs各等位基因分布频率与早产胎膜早破关联性分析：早产胎膜早破组与正常足月产组MMP2(rs243865)T等位基因分布频率与C等位基因分布频率比较,携带T等位基因降低早产胎膜早破的风险,是发生早产胎膜早破的保护因素(OR=0.498,95%CI：0.257-0.966)。早产胎膜早破组与正常足月产组MMP2(rs243866)G等位基因分布频率与A等位基因分布频率比较,携带G等位基因使早产胎膜早破的风险增高(OR=2.007,95%CI：1.035-3.891)。早产胎膜早破组与正常足月产组MMP2(rs2285052)A等位基因分布频率与C等位基因分布频率比较,携带A等位基因是发生早产胎膜早破的保护因素,降低早产胎膜早破的风险,(OR=0.152,95%CI：0.036-0.645)。早产胎膜早破组与正常足月产组MMP2(rs2285053)T等位基因分布频率与C等位基因分布频率比较,T等位基因分布频率高于正常足月产组,且差异有统计学意义,携带T等位基因使早产胎膜早破的风险增高(OR=1.795,95%CI：1.155-2.791,)。Ⅱ、多因素分析：1、MMPs基因型结合母体因素等多因素分析：早产胎膜早破组与正常足月产组MMPs基因型结合母体因素等因素进行多因素Logistic回归分析比较发现,早产胎膜早破的危险因素有：①有孕期阴道流血史(OR=3.844,95%CI：1.233-11.984),②有绒毛膜羊膜炎(OR=2.898,95%CI：1.047-8.022),③有吸烟或被动吸烟史(OR=2.716,95%CI：1.383-5.334),④携带MMP1(rs1799750)GG基因型(OR=2.766,95%CI：1.337-5.724),⑤携带MMP2 (rs2285053) CC基因型(OR=6.482,95%CI：3.166-13.271)；发生早产胎膜早破的保护因素：携带MMP2(rs2285052)CC基因型(OR=0.121,95%CI：0.024-0.608)、孕期有系统产检(OR=0.470,95%CI：0.245-0.903)。2、MMPs等位基因结合母体因素等多因素分析：早产胎膜早破组与正常足月产组MMPs等位基因结合母体因素等多因素进行多因素Logistic回归分析比较发现,早产胎膜早破的危险因素有：有既往早产或早产胎膜早破史(OR=8.476,95%CI：1.139-63.094),有孕期阴道流血史(OR=6.759,95%CI：2.72-16.759),有绒毛膜羊膜炎(OR=3.424,95%CI：1.508-7.771),有吸烟或被动吸烟史(OR=2.483,95%CI：1.74-4.183),携带MMP8(rs11225395)A等位基因(OR=4.753,95%CI：2.643-8.547)；发生早产胎膜早破的保护因素：携带MMP2(rs243866)A等位基因(OR=0.071,95%CI：0.023-0.222),携带MMP2(rs2285053)C等位基因(OR=0.031,95%CI：0.012-0.082),携带MMP3(rs617819)C等位基因(OR=0.410,95%CI：0.212-0.793),孕期有系统产检(OR=0.537,95%CI：0.324-0.892)。结论一、与早产胎膜早破有关的保护因素有：孕期增重、系统产检、人工流产次数少于1次；相关的危险因素有：既往早产或早产胎膜早破史、孕期阴道流血史、绒毛膜羊膜炎、吸烟或被动吸烟。二、早产胎膜早破组与正常足月产组比较,早产胎膜早破组MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP9表达增高,而两组MMP8表达无明显统计学差异。三、MMP1(rs1799750)G.DEL基因型、MMP2(rs2285053)CT基因型、MMP2(rs2285052)CA基因型与早产胎膜早破发生存在关联性。MMP2(rs243865)T等位基因、MMP2(rs2285052)A等位基因、携带MMP2(rs243866)G等位基因、MMP2(rs2285053)T等位基因与早产胎膜早破发生也存在关联性。四、有孕期阴道流血史,有绒毛膜羊膜炎,有吸烟或被动吸烟史等外界母体因素均能影响MMP1(rs1799750)GG基因型,MMP2(rs2285053)CC基因型,它们均是危险因素；而早产胎膜早破的保护因素有：携带MMP2(rs2285052)CC基因型、孕期有系统产检；五、有既往早产或早产胎膜早破史,有孕期阴道流血史,有绒毛膜羊膜炎,有吸烟或被动吸烟史等母体因素均能影响MMP8(rs11225395)A等位基因,且均为早产胎膜早破的危险因素；而早产胎膜早破的保护因素有：携带MMP2(rs243866)A等位基因,MMP2(rs2285053)C等位基因,MMP3(rs617819)C等位基因,孕期有系统产检；