自上世纪以来,血栓性疾病一直是危害人类健康和生命安全的头号因素,溶栓疗法是目前临床上使用最广泛而有效的一种治疗方法,而且溶栓药物已经历了三代发展。人组织纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator, t-PA)是由血管内皮细胞合成并分泌的一种丝氨酸蛋白酶,能够高效特异地溶解血栓,是一种良好的第二代溶栓药物。重组人纤溶酶原激活剂(recombinant human plasminogen activator, rhPA)是天然t-PA的重组突变体,属于新型第三代溶栓药物,具有较天然t-PA更加优越的溶栓功能。利用动物乳腺生物反应器来生产t-PA及其重组突变体,具有产量高、成本低、翻译后修饰、生物活性高等优于其它表达系统的特点。应用多种纯化技术相结合的策略,能够方便、快捷、高效地将目标蛋白从动物乳汁中分离纯化出来。现今,国内外已有很多关于以上研究内容的报道。本研究目的旨在：将构建正确而有效的rhPA乳腺特异性表达载体(F、E、K1区缺失重组体t-PA)应用到转基因兔中,研究其表达水平和活性功能,以期获得高效表达rhPA的转基因兔；研究各种分离纯化表达兔乳中rhPA的方法和策略,以期获得高纯度、高回收率、高活性的rhPA;研究小鼠血栓和溶栓模型,以期获得最佳的动物溶栓效果；同时,还研究了rhPA单克隆抗体的制备和筛选方法,以期获得能够用作亲和层析配体的多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)。从而,最终获得一种新颖、高效的溶栓药物。相关研究方法和结果如下：1.采用常规分子生物学技术,分别以山羊p-酪蛋白基因(β-casein)、山羊p-乳球蛋白基因(BLG)和牛αs1酪蛋白基因(asl-casein)作为调控元件,以天然t-PA的F、E、K1区缺失体作为编码蛋白序列,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA、BLC14/rhPA和AP/rhPA。经酶切图谱和测序比对结果显示,构建的载体与理论序列完全一致。2.通过胶原酶消化组织法建立山羊乳腺上皮细胞分离培养体系,电转染三种载体,经600μg/mL G418筛选两周后,挑取生长旺盛、状态较好的单克隆细胞集落,传代扩大培养。经PCR检测,PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA三种载体分别获得了79株、66株、63株整合阳性单克隆细胞株,并应用51μM催乳素进行诱导表达。ELISA检测72h后细胞诱导上清液,25株转PCL25/rhPA基因细胞株高水平表达rhPA,3株转BLC14/rhPA基因细胞株表达rhPA,而转AP/rhPA基因细胞株未见表达。经纤维蛋白平板溶圈法(FAPA)检测,所有诱导表达上清液均具有体外溶栓活性功能。结果表明,在细胞水平,PCL25/rhPA和BLC14/rhPA载体能够有效地驱动rhPA基因特异性表达,且PCL25/rhPA载体的表达水平明显高于其它两种载体。从而,验证了构建的PCL25/rhPA载体是合理而有效的。3.将以上三个构建(PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA)经显微注射导入到兔受精卵中,共移植94只受体,妊娠71只,出生319只仔兔,PCR检测85只为转基因整合阳性兔,妊娠率为75.5%(71/94),整合率为26.6%(85/319)。ELISA检测57只存活转基因兔(或后代)乳汁,共12只乳腺特异性表达rhPA (PCL25/rhPA11只,BLC14/rhPA1只),表达水平约在5.2-630 μg/mL之间。SDS-PAGE电泳和Western Blot检测该12只兔乳,均出现约39KDa大小的目标特异性条带。FAPA结合ELISA测定表达产物的体外溶栓比活性,最高可达360倍左右(A29,与阿替普酶相比)。测交检测高表达水平的A29系转基因兔,1只F2代(A29F2-09)的所有后代仔兔均为整合阳性(100%,13/13)；Real-time PCR检测相对拷贝数,该只兔约是其它同系转基因兔的2倍。从而,证明了A29F2-09为纯合子转基因兔,且rhPA表达水平约1000μg/mL,明显高于非纯合子兔；不同系转基因兔拷贝数与表达水平间没有相关性。以上结果表明,PCL25/rhPA载体能够在转基因兔乳腺中高效表达活性rhPA;表达水平主要与整合位点有关；当整合位点一致时,表达水平随拷贝数的增加也相应地累积提高。4.通过传统弗氏佐剂和快速免疫佐剂两种方法免疫小鼠,结果显示在免疫小鼠血清效价、免疫原剂量和免疫周期上,快速免疫佐剂都大大地优越于弗氏佐剂(1010/109,20μg/1300μg,35d/70d)。通过电脉冲和化学PEG两种方法将免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,结果显示电融合效率明显高于化学PEG融合(166%/88.4%)。通过HAT和HT筛选及有限稀释法亚克隆后,共获得12株能够稳定分泌高效价抗体的杂交瘤细胞株(标号Cl-C12)。ELISA-elution检测,有3株为多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb,标号C1、C4、C8),占单克隆抗体总数的25%(3/12)。小鼠腹腔诱导法大量制备抗体,C1、C4、C8株腹水效价分别是108、1010、108,且无交叉非特异性反应,能够为亲和层析所用。5.通过离心脱脂、35%饱和硫酸铵沉淀、超滤及透析等方法进行兔乳前处理,获得粗纯样品。将C4株抗体与CNBr activated Bestarose 4FF偶联来制备免疫亲和层析柱,偶联率高达96.5%。尝试五种不同的洗脱液(A:0.1mol/L甘氨酸,pH2.5;B:0.1mol/L甘氨酸,pH3.5；C:0.1mol/L甘氨酸,pH5.0; D:0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液,pH7.9; E:0.2M NaH2PO4-柠檬酸,pH2.2),来探索最佳洗脱效果的条件,结果显示0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液(pH7.9)洗脱效果最佳,但pH较低的强酸缓冲液(A、B、E)也能够达到洗脱要求,而pH较高的C洗脱液则出现杂蛋白较多且回收率低。再尝试Chromdex75 prep grade凝胶过滤预装柱来进一步分离纯化目标蛋白rhPA,上样体积为1%和2.5%能够将目标蛋白完全分开,出现两个独立的峰；而上样体积为5%则不能够将目标蛋白完全分开,出现两个相互交叉重叠峰。经免疫检测及飞行时间质谱鉴定该纯化产物为目标rhPA。与BSA对照品相比,双向电泳结果显示,纯化产物的大小约39KDa(在35-40KDa之间),等电点约7.1(BSA等电点约4.7),纯度可达96%-99%或更高(BSA纯度96%-99%)。与阿替普酶对照品相比,圆二色谱分析显示,该纯化产物与阿替普酶有相似的二级结构；FAPA测定纯化产物rhPA的体外溶栓比活性,其值高达约214倍,远远高于阿替普酶溶栓药。6.以HitrapTM CaptoTM Q-1mL离子交换柱去内毒素,经试剂盒测试,内毒素含量低于0.015EU/mL.分别以0.3mL/只小鼠腹腔注射1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%浓度的角叉菜胶,来探索诱导小鼠尾部血栓形成的最佳条件,结果显示以0.05%浓度的角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成条件最佳。以不同的“给药”浓度(低剂量组0.1mg/只、中剂量组0.4mg/只、高剂量组1.6mg/只及阿替普酶、生理盐水对照组)对小鼠血栓模型病进行治疗,结果显示纯化产物rhPA作为溶栓药物治疗小鼠尾部血栓,在效果和剂量上明显优越于阿替普酶,且rhPA高剂量组(1.6mg/只)在三次给药后(32h)能够完全治愈小鼠尾部血栓疾病。以上结果表明,我们构建的F、E、K1区缺失重组体t-PA (PCL25/rhPA载体)是合理、有效的,且能够在转基因兔乳腺中高效表达；表达产物rhPA能够相对单独地存在于兔乳中,且能够被分离纯化出来；纯化产物具有高回收率、高纯度、高生物活性功能,且能够用于动物溶栓模型试验,具有较阿替普酶对照品更好的疗效。同时,也证明了我们所建立的这一整套技术体系是相对完善、可行的,在国内外较少见报道,为以后大量新型重组溶栓药物的研发提供了新的思路,也为后期进一步临床试验奠定了扎实的基础。