热休克蛋白47在肾脏纤维化中的作用及机制研究

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背景肾纤维化是指在各种致病因子如炎症、损伤等作用下,间质细胞及细胞间质增多,尤其是基质蛋白合成增加,基质降解受抑制造成细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的大量堆积导致的肾小球硬化和小管间质纤维化。它是多种慢性肾脏疾病最终导致肾功能衰竭的主要病理改变和共同通路,延缓和防止肾纤维化是防治慢性肾脏病进展的关键。胶原是ECM的主要成分,在各种肾脏纤维化疾病中合成都显著增高,它合成和沉积增加与肾脏纤维化的启动和进展有密切关系。热休克蛋白47(Heat shock protein 47, HSP47)是一种胶原特异性的“分子伴侣”,在胶原生物合成过程中协助前胶原修饰、折叠、装配,是胶原成熟的必要条件,其表达影响胶原产量。HSP47在多种肾脏纤维化的动物和临床疾病研究中包括高血压肾硬化模型大鼠,5/6肾脏切除大鼠模型,人类IgA肾病及糖尿病肾病肾组织等,表达都明显增高,且与胶原同步增加。并初步证实动物体内抑制其表达可减轻纤维化的程度,如HSP47反义寡聚脱氧核苷酸转染抗Thy-1肾小球肾炎大鼠,HSP47 siRNA转染UUO大鼠,都可以改善肾纤维化,提示HSP47在肾脏纤维化中的作用可能并不局限于调节胶原的合成。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路是介导细胞反应的重要信号系统,能将细胞外信号转导至细胞及其核内,通过保守的三级级联反应(MAPKKK-MAPKK-MAPK)激活转录因子,调节基因表达。细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(c-JunNH2-terminal kinase, JNK)是它的两个主要家族成员。其中ERK1/2又被称为丝裂原活化的MAPK通路,主要功能是介导促进细胞增殖和分化;JNK主要功能是调节参与机体应激反应。体外实验证明ERK1/2,JNK信号传导通路可介导外界刺激所致的热休克蛋白合成。基于以上分析得知HSP47是胶原合成的特异性“分子伴侣”,其在肾脏纤维化中表达增高,且有促肾脏纤维化作用,但其作用机制可能不局限于对胶原合成的调控,MAPK信号传导通路可能参与调控HSP47的表达。为此,本实验开展如下的研究。目的利用单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)大鼠模型,初步观察HSP47在肾脏组织的表达情况,旨在探讨HSP47在肾小管间质纤维化中的作用。方法SD大鼠随机分为模型组(UUO组)和假手术组(Sham组),每组8只。采用单侧(左)输尿管结扎方法,建立梗阻性肾小管间质纤维化大鼠模型,Sham组只游离输尿管而不结扎。术后14天处死动物,取结扎侧肾脏,同时处死假手术组大鼠,取出肾组织。观察各组之间蛋白尿,血肌酐水平,运用HE, Masson染色观察肾脏组织形态学改变,采用免疫组化方法检测HSP47、胶原Ⅳ(CollagenⅣ)与纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)表达的部位和变化。结果1.与假手术组比较,UUO模型组大鼠血肌酐水平升高,蛋白尿无显著差异。2.与假手术组比较,光镜下UUO模型组大鼠肾组织出现不同程度的肾小管扩张、间质炎症细胞浸润,间质面积增宽、部分肾小管萎缩、肾小管上皮细胞空泡样变性。3.Masson染色结果显示:与假手术组比较,UUO模型组大鼠肾组织胶原在肾小管周围、间质区显著增多。4.免疫组化结果显示:与假手术组比较,UUO模型组大鼠肾组织HSP47表达显著增加,在肾小管周围、间质区表达增加最明显;CollagenⅣ表达显著增加,在肾小管基底膜、间质区表达增加最明显;FN表达显著增加,主要表达在肾间质区。结论HSP47在UUO大鼠模型肾脏组织表达上调,且与胶原表达部位一致,提示HSP47促进肾间质纤维化,且该作用与其促进胶原蛋白的合成有关。目的研究HSP47在TGF-β1诱导HK-2细胞合成Collagen及FN等ECM蛋白过程中的作用,并检测其对PAI-1表达的影响,探讨HSP47在ECM合成与降解平衡中的角色。方法常规培养HK-2细胞,分为对照组、TGF-β1组、HSP47siRNA组,对照组为无血清DMEM组,TGF-p1组为TGF-p1诱导,HSP47siRNA组为HSP47siRNA与TGF-β1共同作用,RT-PCR检测HSP47、collagenⅣ、FN. PAI-1的mRNA表达,Western Blot检测HSP47、collagenⅣ、FN蛋白表达,ELISA检测PAI-1的蛋白表达。结果1.常规培养的HK-2可表达HSP47,不同浓度TGF-p1(0、2.5、5、10ng/ml)干预不同时间(12h、24h、48h), HSP47基因和蛋白表达都呈逐渐增高的趋势,10ng/ml TGF-β1干预HK-2细胞48h时HSP47在基因和蛋白水平上都表达最强。2.不同浓度TGF-β1 (0、5、10ng/ml)干预HK-2不同时间(12h、24h、48h), collagenⅣ、FN、PAI-1在基因,蛋白水平表达呈逐渐增高的趋势,TGF-β1(10ng/ml)作用48小时三者基因和蛋白水平表达最强。3.HSP47siRNA组(HSP47siRNA处理24h,再TGF-β1 10ng/ml干预48)与TGF-β1 10ng/ml干预48h比较,前者HSP47, collagenⅣ, FN, PAI-1 mRNA和蛋白的表达都明显下调。结论1.TGF-β1呈浓度和时间依赖模式上调HK-2细胞HSP47的表达。2.TGF-β1呈浓度和时间依赖模式上调HK-2细胞collagen IV, FN,PAI-1表达。3.HSP47siRNA可以下调TGF-β1诱导下HK-2细胞分泌的collagenⅣ、FN、PAI-1的mRNA和蛋白表达。目的研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径是否介导了TGF-β1诱导HK-2细胞上调HSP47表达。方法应用ERK、JNK特异性抑制剂观察对TGF-p1诱导HK-2细胞上调HSP47表达的影响结果应用PD98059、SP600125分别特异性抑制MAPK途径的胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、c-Jun-氨基末端激酶(JNK)通路,对TGF-β1上调HSP47的作用有不同影响。1.PD98059可以抑制TGF-β1对HK-2细胞ERK信号通路的活化和HSP47的表达,且不同浓度PD98059 (25uM、50uM、75uM)对HSP47的抑制效果有差异。2.SP600125可以抑制TGF-β1对HK-2细胞JNK信号通路的活化和HSP47的表达,且不同浓度SP600125 (10uM、20uM、30uM)对HSP47的抑制效果无明显差异。结论ERK1/2、JNK信号通路参与介导TGF-p1上调HK-2细胞表达HSP47。
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