细胞自噬是生物体进化过程中一条保守的胞内降解途径,能够将错误折叠的蛋白质、受损的细胞器等运输至溶酶体中进行降解,以维持细胞内的稳态平衡。细胞自噬能够参与调控多种生理活动,如生物的衰老,免疫应答,疾病发生及胚胎发育等,其中Atg7、Atg5和Beclin 1（Atg6）是调控自噬小体形成的核心蛋白。小鼠中Beclin 1的全身性敲除会导致突变体胚胎在发育早期（E8.5）因脏壁内胚层组织结构不全而死亡;而Atg5和Atg7基因敲除的突变体小鼠则在出生后24小时内死亡,暗示自噬相关基因在生物的生长发育过程中扮演着重要的角色。为研究自噬相关基因在斑马鱼中的功能,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了能稳定遗传的斑马鱼突变体。结果显示斑马鱼beclin 1及atg5、atg7的缺失并不会影响胚胎的早期发育;随着幼体发育的进行,beclin 1-/-突变体的肝脏结构及功能都会出现严重的缺陷,而斑马鱼atg5和atg7的缺失并不会损伤早期幼体肝脏的功能和结构,但有意思的是atg7突变体会在1月龄左右出现类似于Beclin 1缺失所导致的肝脏表型。1、斑马鱼beclin 1的缺失导致肝脏胆汁酸代谢异常。肝脏是生物体代谢活动最为旺盛的器官之一,能够通过糖类及脂质代谢来动态调控机体的能量平衡。斑马鱼肝脏的结构和功能在进化上与哺乳动物高度相似。已有研究表明小鼠肝脏细胞中自噬的缺陷会诱导产生大量被泛素和Sqstm1/P62标记的蛋白累积物,进而损伤小鼠肝脏的正常生理功能。然而,目前还鲜有文献报道细胞自噬与生物体内胆汁酸代谢的关系。在本文的研究中,我们发现在全身性敲除beclin 1的斑马鱼突变体中,肝脏细胞和胆管网络的形态结构与野生型相比表现出明显的形态缺陷:在突变体斑马鱼肝脏中,虽然胆管网络结构相对完整,但与野生型相比其胆管更粗,并且缺少点状样结构（汇管区）;同时beclin 1缺失的肝脏细胞相比野生型体积更大,细胞-细胞之间的粘连作用丢失;此外,透射电镜的结果显示突变体肝脏细胞的胞质内还存在大量的胆汁酸盐晶体沉积,暗示斑马鱼中beclin 1的敲除很可能会破坏肝脏细胞内胆汁酸盐的代谢平衡,并导致胆汁酸盐在肝脏细胞内的异常累积。胆汁酸是胆汁的主要成分之一,其中初级胆汁酸主要在肝脏细胞中合成。胆汁酸在机体内的动态平衡是维持机体正常生理功能的重要前提,机体内胆汁酸代谢紊乱会诱发各种相关疾病的产生,如肝内外胆汁酸淤积,胆汁性腹泻等,因此,机体需要及时精确地调控肝脏细胞内胆汁酸的合成速率。FXR-SHP-Cyp7a1是机体调控胆汁酸合成最为重要的信号通路之一。通常肝细胞内过多的胆汁酸盐可以直接激活FXR受体,并反馈抑制Cyp7a1的表达活性,进而降低体内胆汁酸的总体含量。我们的实验数据显示beclin 1突变体肝脏组织中胆汁酸的直接下游基因FXR、Mafg都处于激活状态,致使胆汁酸合成的限速酶——Cyp7a1受到强烈的抑制作用。这些结果进一步证实了斑马鱼中Beclin 1蛋白的缺失的确影响了肝脏内胆汁酸盐的代谢平衡。2、Beclin 1-Uvrag-Vps34-Vps15复合体调控斑马鱼肝脏中BSEP的定位。临床上造成肝内胆汁酸盐累积的原因有很多,包括先天性原因和后天性病变。其中人类中BSEP（ABCB11）基因的突变是引起新生儿2型进行性家族性肝内胆汁淤积症（PFIC-2）的直接原因。在beclin 1缺失而引起的肝内胆淤的斑马鱼模型中,我们发现肝脏细胞中胆盐排出泵BSEP蛋白在亚细胞结构上的定位异常。相较于野生型,beclin 1-/-突变体肝脏细胞中的大部分BSEP都滞留在胞质中,无法正确定位到肝脏细胞膜的顶部结构域（Apical domain）,提示BSEP蛋白定位的缺陷可能是造成beclin 1-/-突变体肝内胆盐淤积的直接原因。Beclin 1可以通过与不同的蛋白结合形成两种功能不同的蛋白复合体:Beclin1-Vps34-Vps15-Atg14（PI3KC3蛋白复合体I）主要在细胞自噬过程中发挥功能;Beclin 1-Vps34-Vps15-Uvrag（PI3KC3蛋白复合体II）则具有内体转运分选的功能。为了更好地了解BSEP定位缺陷的分子机制,我们利用一些小分子化合物来调控斑马鱼体内的自噬水平并观察药物处理后BSEP在肝脏细胞内的定位。CQ与Baf1a可以特异地抑制自噬小体与溶酶体的融合,从而抑制自噬。Wortmannin和LY294002则主要通过抑制PI3K蛋白复合体的激酶活性。我们的结果表明,CQ和Baf1a的处理并不会影响BSEP在肝脏细胞内的定位;而PI3K蛋白激酶抑制剂Wortmannin和LY294002的处理可以部分模拟BSEP在beclin 1突变体中的表型。此外,同时期的atg5-/-虽然会影响细胞自噬,但斑马鱼突变体中BSEP的亚细胞定位并没有明显的缺陷。这些结果表明,具有自噬调控功能的蛋白复合体Beclin 1-Vps34-Vps15-Atg14应该不是导致BSEP亚细胞定位缺陷的直接原因。为了进一步研究Beclin 1-Vps34-Vps15-Uvrag蛋白复合体是否能够调控BSEP在肝脏细胞中的亚细胞定位,我们构建了uvrag缺失的斑马鱼突变体品系,结果显示Uvrag的缺失可以完全重现BSEP在beclin 1突变体中细胞定位缺陷的表型。结合先前的结果,这些数据共同说明了完整的Beclin 1-Vps34-Vps15-Uvrag蛋白复合体是BSEP蛋白在斑马鱼肝脏细胞内进行正确定位的重要条件。综上所述,我们的研究结果揭示了斑马鱼Beclin 1能够通过具有内体转运功能的PI3KC3蛋白复合体II（Beclin 1-Vps34-Vps15-Uvrag）调控肝脏细胞内BSEP蛋白的亚细胞定位,影响了斑马鱼肝脏中的胆汁酸代谢平衡。这些实验数据也许能为临床上治疗由BSEP蛋白功能异常而引起的肝内胆汁酸淤积提供新的治疗策略及理论基础。3、斑马鱼beclin 1突变体死亡的原因。在本论文的研究中,我们发现beclin 1突变体只能存活10天左右,因此我们进一步探究了斑马鱼beclin 1突变体的死亡原因。实验数据表明,突变体的肝脏细胞内胆汁酸代谢异常和泛素化蛋白的累积并不是导致其死亡的主要原因,这提示斑马鱼Beclin 1还可能在其他组织器官的功能或形态发生起着重要的调控作用。