对香辛料中赭曲霉重组酶等温核酸扩增快速检测方法的研究

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赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉属和青霉属产生的霉菌毒素,具有强烈的肾脏毒性、免疫毒性以及致癌和致畸能力。研究表明,在玉米、小麦等谷物以及咖啡、啤酒、牛奶、葡萄、橘子和果汁饮料等多种食品产品中均能检测到赭曲霉(Aspergillus ochraceus)及赭曲霉毒素A的污染。A.ochraceus是第一个描述产生OTA的菌种,广泛的分布在自然界中,是最主要的产毒菌之一。赭曲霉毒素A的污染严重威胁了人类食品安全和生存环境,A.ochraceus也因为其在所有曲霉属物种中强大的OTA分泌能力受到了全世界的广泛关注。本实验对由西安、成都及重庆3个地区所采集的90份香辛料样品进行菌株分离和污染现状分析,获得了污染水平基础数据,从而可为香辛料中霉菌污染的控制提供数据参考。同时针对所分离出的A.ochraceus建立了qPCR和RPA检测方法,对此方法的特异性、准确性及灵敏性进行评价。主要研究结果如下:(1)由西安、成都、重庆90份香辛料样品中分离到43株菌(23种),其中曲霉属和青霉属为最常见的属,分别为13株和8株,曲霉、青霉和其他菌株的污染率分别为58.8%、52.22%和80%,样品的总污染率为80%;西安的香辛料样品污染程度最高,成都污染程度最低,重庆的香辛料整体污染率略高于成都,低于西安;五种香辛料的整体污染水平差异不大,而不同地区的同种香辛料污染水平存在明显差异;超市样品相较于农贸市场和城乡结合部的散称样品有明显较低的污染率,密封包装的样品放置在超市货架上,隔潮隔热,样品质量相对更稳定。同时,综合紫外荧光法和HPLC-HLD快速可靠地对产毒菌株进行筛选,共筛选出3株产毒菌,选择产毒量最大的A.ochraceus进行后续的快速检测试验。(2)根据A.ochraceus OTA生物合成的关键基因(聚酮化合物合成酶基因PKS)的保守序列设计特异性引物,建立A.ochraceus的qPCR检测方法,该方法可检测到A.ochraceus的DNA最低量为30 fg/μL。(3)同时基于PKS基因设计了引物和探针,经过RPA扩增和体系优化,建立了检测A.ochraceus的RPA检测方法。该方法在39oC下30 min即可完成扩增,最低检测线为3 fg/μL,灵敏度为qPCR检测方法的10倍,qPCR和RPA检测方法特异性均很强,能够快速检测A.ochraceus污染的食品。(4)利用所建立的RPA和qPCR方法,对接种不同浓度孢子的21份花椒样品进行验证检测,RPA检测的阳性样品数为11个,阳性率为52.38%,最低检测限为10~3个/m L,qPCR检测到的阳性样品数为7个,阳性率为33.33%,最低检测限为10~4个/m L,表明RPA方法的灵敏度高于qPCR。
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