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背景：炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一种慢性且易复发的肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)和克隆氏病(Crohn’s disease, CD),具体发病因素尚不明确。目前认为IBD是由综合性因素导致,包括环境因素,免疫紊乱,肠道粘膜屏障功能破坏以及肠腔内菌群失调等,这些因素触发了先天免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞介导的免疫应答,产生一氧化氮(NO),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子和介质,进一步启动适应性免疫应答,产生大量前炎症因子IL-17A、IFNγ等,最终导致肠道的强烈炎症反应。近年来由于发达国家卫生条件不断改善已接近高度清洁水平,很多寄生于肠道的蠕虫被彻底清除,但自身免疫性疾病的发生率却逐年增加,这种趋势也逐渐蔓延至发展中国家及欠发达地区。这一现象可以用“卫生假说”理论很好解释,基于这一理论,许多学者研究发现预先感染蠕虫或采用蠕虫来源的某些具有免疫调节作用的蛋白干预炎症性肠病小鼠模型,发现具有抑制小鼠肠道炎症的作用。有研究表明预先感染Heligmosomoides polygyrus对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎小鼠具有肯定的保护作用；预先感染Trichinella spiralis或是用幼虫抗原治疗DNBS诱导的肠炎发现也是同样有保护作用。另有学者研究发现予曼氏血吸虫的虫卵或可溶性蛋白干预结肠炎小鼠,通过降低前炎症因子IFNγ、IL-17A的mRNA表达,促进抗炎因子IL-4mRNA的表达从而减轻小鼠结肠炎。但是若予以活虫或虫卵给予患者口服,会存在较大风险,一般不易被患者接受,因此研究者们将目光转向了蠕虫来源的相关蛋白,虫体的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)就是其中一种被证实具有调节宿主免疫功能的蛋白。半胱氨酸蛋白酶抑制剂,简称胱抑素,是一类广泛存在于生物体内的包括存在于各种蠕虫体内的半胱氨酸蛋白酶高效抑制剂,构成一个半胱氨酸酶抑制剂的大家族,依据氨基酸序列被分为3大家族,即stefins(家族1),cystatins(家族2)和kininogens(家族3)。属于家族1(stefins)的日本血吸虫cystatin基因组DNA和cDNA的全长序列在基因库里分别编号为FJ617451和FJ617450, cDNA的全长基因序列的开放阅读框长度为306bp,编码101个氨基酸,理论分子量为11.3kDa。属于家族2的日本血吸虫的cystatin近年已被体外实验证实通过抑制活化的RAW264.7的LPS诱导产生的TNF-α和IL-6对巨噬细胞的偏移有调节作用。对于日本血吸虫和曼氏血吸虫感染宿主诱导的负向免疫调控研究已深入到虫源性分子的水平,但是日本血吸虫半胱氨酸酶抑制剂相关的体内实验尚未见报道。因此设计本课题拟观察rSjcysatin对TNBS诱导的结肠炎小鼠的保护作用及探索负向免疫调节机制。目的：观察日本血吸虫的cystatin(家族1)对TNBS诱导的小鼠结肠炎的保护作用。通过分析比较各组小鼠结肠炎的炎症指标的变化,以及小鼠脾脏、肠系膜淋巴结、结肠固有层单个核细胞的CD4+T淋巴细胞的Th1、Th2、Th17、Treg的比例变化来探讨日本血吸虫cystatin对结肠炎小鼠的保护作用,并探索rSjcystatin负向免疫调节机制,为治疗IBD提供一个可靠的理论依据,从而避免临床上运用感染蠕虫来调节患者免疫失衡治疗IBD。方法：将pET-28A-Sj cystatin质粒转化到大肠杆菌BL21,37 ℃, 1mM IPTG诱导表达重组蛋白后经超声破菌、镍柱纯化,BCA法测定纯化蛋白质浓度-80℃保存或直接稀释后注射小鼠。60只8周雌性Balb/C小鼠随机分为6组,每组10只,分别为：①rSjcystatin治疗组：造模后6 h和24 h腹腔注射rSjcystatin 50 μg; ② rSjcystatin提前干预组：造模前腹腔注射rSjcystatin50 μg共3次,每次间隔5天,在最后一次注射蛋白的一周后予以TNBS灌肠造模；③结肠炎模型组：TNBS灌肠造模；④ rSjcystatin提前干预对照组：造模前腹腔注射rSjcystatin50μg共3次,每次间隔5天,在最后一次注射蛋白的一周后予以PBS灌肠；⑤ rSjcystatin治疗对照组：PBS灌肠后6 h和24h腹腔注射rSjcystatin 50 μg;⑥正常对照组：PBS对照组。所有试验动物造模3天后无痛处死,结肠病变进行炎症评分5方面包括疾病症状评分(DAI)、结肠长度变化、结肠病变程度(MAO)、病理分级(MIO)、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定,并提取脾、肠系膜淋巴结及结肠粘膜固有层淋巴细胞,流式检测Thl(IFN-γ)> Th2(IL-4)、 Th17(IL-17A)及Treg比例；qRT-PCR则定上述细胞因子的mRNA表达,ELISA测定结肠组织匀浆上清中相关因子的水平,Western blot测定结肠匀浆中Th1 (T-bet)、Th2 (GATA-3)、Th17 (RORyt)及Treg (Foxp3)重要转录因子的蛋白表达。结果：(1)TNBS结肠炎模型小鼠第1天出现程度不同的稀便、黏液血便或血便,并伴有显著的体重下降；rSjcystatin治疗组小鼠DAI、MAO、MIO、MPO均明显低于结肠炎小鼠；而rSjcystatin预防组小鼠结肠炎症指标与结肠炎组小鼠相比无差异(p＞0.05)；(2)实验小鼠病变局部和脾脏细胞因子变化：①脾脏淋巴细胞：TNBS诱导结肠炎组小鼠脾脏CD4+IFNγ+、CD4+IL-17A+占CD4+T比例分别为(2.92±0.54)%和(2.27±0.53)%,与正常小鼠CD4+IFNγ+(1.28±0.29)%、CD4+IL-17A+(0.90±0.09)%相比显著增加(p<0.05); rSjcystatin治疗组小鼠的脾淋巴细胞CD4+IFNγ+比例下降为(1.55+0.20)%,与炎症组小鼠相比,有统计学意义；CD4+IL-17A+比例为(1.75±0.49)%,IL-17A mRNA表达水平(2.70±1.35)较炎症组小鼠(3.63+1.80)减少,但无统计学差异；各组间脾脏淋巴细胞Treg、CD4+IL-4+占CD4+T比例、Foxp3、IL-10和TGF-β的mRNA表达水平均无统计学差异； ②肠系膜淋巴结(MLN):rSjcystatin治疗组小鼠MLN中CD4+IFNy+比例为(3.11±0.51)%,与结肠炎组小鼠(4.61±1.02)%相比明显降低(p<0.05)；MLN中Treg比例(9.82±0.85)%明显高于炎症组(4.39±1.38)%和正常组小鼠(1.28±0.29)%; Foxp3. IL-10和TGF-p mRNA表达增加(球0.05)：③结肠固有层淋巴细胞(LPMC):rSjcystatin治疗组小鼠CD4+IFNy+占CD4+T比例(2.94±1.04)%与炎症组CD4+IFNy+比例(8.23±0.90)%相比明显减少(p＜0.05)；rSjcystatin治疗组CD4+CD25-Foxp3+T比例(5.25±1.51)%明显高于炎症组小鼠LPMC(1.78±0.41)% (p<0.05);治疗组小鼠MLN和LPMC的CD4+IL-4+与CD4+IL-17A+占CD4+T比例、IL-4mRNA和IL-17A mRNA与炎症组小鼠相比无统计学差异；(3)结肠匀浆上清中各因子水平：rSjcystatin治疗组小鼠结肠匀浆上清中IFNy (1126.8±230.16)pg/ml较炎症组(1628.6±358.51)pg/ml明显下降,IL-4(159.95±30.66) pg/ml, IL-13 (8623.1±1644.19) pg/ml, IL-10 (455.51±187.87) pg/ml, TGF-β (116.18±17.68) pg/ml均较炎症组明显上升；(4) Western blot检测结肠相关转录因子表达：rSjcystatin治疗组的Thl转录因子T-bet表达明显低于炎症组小鼠,而Th2转录因子GATA-3和Treg转录因子Foxp3表达明显增加,但Th17转录因子RORyt在炎症组和治疗组小鼠表达无明显差异。结论：TNBS诱导的结肠炎小鼠提前给予日本血吸虫重组rSjcystatin未见显著的预防作用：但是造模后给药能显著减轻TNBS诱导的小鼠结肠炎的病理损伤。其免疫调节机制可能是rSjcystatin下调了结肠炎小鼠的Thl优势应答,上调了肠系膜淋巴结和肠道调节性T细胞及肠道局部Th2反应。rSjcystatin具有减轻炎症性肠病病理损伤和下调Th1应答的作用,对于其潜在的治疗炎症性肠病的价值尚待深入研究。