论文部分内容阅读
多年生木本植物的个体发育过程中要经历从童期到生殖生长期的转变。研究果树实生树阶段转变过程中的基因表达调控以及个体发育的分子机制,对缩短果树童期,提高果树育种效率有重大意义。本试验以9年生苹果杂种实生树(‘红玉’ב金冠’)为试材,利用SSH技术建立苹果实生树个体发育不同阶段的消减文库；之后通过斑点杂交和实时荧光定量PCR,半定量PCR等方法对苹果实生树童期、成年期的消减文库进行筛选验证,对不同发育阶段差异表达基因功能分析并从中挑选出可能与阶段转变密切相关的基因,对其克隆。构建了植物表达载体,转化烟草和拟南芥。研究结果如下：1、构建苹果实生树不同个体发育阶段基因差异表达文库。童期和成年期文库各768个阳性克隆经过斑点杂交验证后,童期和成年期分别得到244个和284个阳性克隆。2、对苹果实生树不同个体发育阶段差异表达基因进行分析。阳性克隆测序后分别获得童期和成年期特异表达EST85个和103个,其中基础代谢相关基因54个,细胞骨架和细胞周期相关基因10个,蛋白质代谢相关基因32个,氧化还原相关基因8个,次生代谢相关基因7个,激素响应及信号传递相关基因21个,逆境响应相关基因13个,转录因子13个,金属转运及膜转运相关基因30个。6个脂类代谢和7个次生代谢相关的EST只在成年期出现。32个蛋白质代谢相关EST中有62.5%在成年期特异出现。5个与Auxin,GAs,ABA和ETH响应相关的EST均只出现在童期。参与氧化还原反应的基因在童期和成年期不同。在阶段转变过程中不仅存在转录水平的差异,还检测到转录后的差异修饰。4个编码核酮糖-1,5-二磷酸加氧羧化酶小亚基rbcS的EST,均与苹果基因组的MDP0000731480的3’UTR序列匹配。其中3个EST在童期上调表达,1个EST在成年期上调表达。这四个EST仅在3’UTR序列上存在差异。4个位于MDP0000243585上的编码金属硫蛋白like的EST和2个编码NADP-甘油醛磷酸脱氢酶的EST的3’UTR序列也表现出显著差异。3、对差异表达基因在杂交组合内以及不同杂交组合间进行验证。用实时荧光定量PCR对‘红玉’ב金冠’(02-18-081,02-17-115和02-17-042)和‘紫塞明珠’ב富士’(07-07-115,07-07-119和07-07-133)2个组合各3株实生树样品对随机选取的差异表达基因验证。全部6个差异表达基因在6株实生树上的表达情况与SSH结果一致。说明SSH建库结果在杂交组合内以及杂交组合间的结果是稳定的。通过半定量PCR对存在3’UTR的差异修饰的4个rbcS EST验证。成年期上调表达的88.9%与SSH结果相符,童期上调表达的rbcS EST得到85.2%验证4、克隆了阶段转变相关的基因,并构建遗传转化载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草和花序侵染法转化拟南芥。T3代拟南芥及T1代烟草中检测到报告基因GFP及转入的外源基因。本研究表明,苹果实生树阶段转变过程中不仅存在转录水平的调控,也存在转录后水平上的调控；激素响应、氧化还原调控、次生代谢和蛋白质代谢均与苹果阶段转变密切相关。