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研究背景与研究目的结外NK/T细胞淋巴瘤—鼻型(extranodal natural killer t cell lymphoma,nasal type以下简称NKTCL)属于非霍奇金淋巴瘤,是一类以血管中心性坏死为特点的淋巴瘤,好发于东亚及南美洲。放射治疗仍为NKTCL特别是局限期NKTCL的主要治疗方案,然而仍有30%的患者治疗效果较差,因为目前对该病缺乏有用的预测放射敏感性的生物学指标,探究能够预测放射敏感性的分子标记值得我们进一步研究。NKTCL病因尚不明确,但EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)的感染同该恶性淋巴瘤的发病关系密切。EB病毒编码的LMP1(latent membrane protein,LMP1)基因是被证实的的致癌基因,LMP1可在大多数鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中表达,因此目前LMP1的研究已成为EBV相关恶性肿瘤特别是淋巴造血系统肿瘤研究的热点。特异性地阻断LMP1基因相当于去除EBV的致癌因素,这种治疗方式已经成为EBV相关肿瘤基因治疗的研究方向之一。然而这种治疗方式在EBV相关淋巴瘤特别是NKTCL中的研究较少,LMP1基因对NKTCL放射敏感性的影响及其分子机制尚无研究。在本课题中,我们选择LMP1作为NKTCL基因治疗的分子靶点,研究利用shRNA干扰技术沉默LMP1基因表达来增加EBV相关淋巴瘤放射敏感性的可行性。我们首先在NKTCL患者组织标本和细胞系检测LMP1的表达情况,然后构建携带LMP1cDNA和LMP1shRNA的重组慢病毒表达载体,转染NKTCL细胞株。研究沉默lmp1对nktcl生长增殖、侵袭转移及放射敏感性等生物学特性的作用,最后检测凋亡、侵袭转移及dna损伤修复相关分子通路基因,探索lmp1在nktcl中的生物学功能和分子机制,为nktcl的临床诊治提供分子靶标。第一部分:lmp1在nk/t细胞淋巴瘤的差异表达水平及对其放射敏感性的关系目的:从mrna和蛋白水平检测lmp1在nk/t细胞淋巴瘤组织、细胞中的表达水平,并探讨其与放疗疗效的关系。材料与方法:1.收集2013年9月-2015年3月郑州大学第一附属医院的鼻型nk/t细胞淋巴瘤患者组织活检新鲜标本40例。检测组织标本中lmp1的mrna和蛋白表达水平,根据放射治疗疗效将患者分为敏感、中度敏感和不敏感组三组。分析lmp1的表达水平与临床病理特征及放疗疗效的关系。另取良性淋巴组织反应性增生标本20例作为对照。2.rt-pcr及westernblot检测在snk-6、nkl、nk92、yts及yt共5个nk/t细胞淋巴瘤细胞系中lmp1基因及蛋白的内源性表达。6mv-x射线分别给予0、2、4、6、8gy的剂量进行放射治疗,cck-8法及克隆形成实验检测细胞增殖情况,摸索合适的放疗剂量,细胞学水平探索lmp1与放射敏感性差异的相关性。结果:1.40例nktcl患者病灶组织中34例rt-pcr检测到lmp1mrna,阳性率85%。对34例患者组织rt-pcr及westernblot发现,nk/t细胞淋巴瘤组织中lmp1mrna和蛋白相对表达量均明显高于良性淋巴组织反应性增生组织(f=248.367,p<0.001)。lmpl表达水平与nktcl的血清β2-微球蛋白、淋巴结转移、b症状密切相关,即β2-微球蛋白异常、有淋巴结转移、伴随b症状者,lmpl表达水平高(p<0.01)。单纯放疗组lmpl表达水平与放疗疗效密切相关,即lmp1表达水平越高者,放疗效果越差(p<0.05)。2.荧光实时定量pcr检测ebv-lmp1在snk-6、nkl、yt、yts、nk-92细胞系中的表达。以nkl细胞的表达为参照组,对结果通过单因素方差分析显示:5种细胞株中lmp1的表达量之间具有显著性差异(p<0.001)。lmp1在snk-6、yt、yts、nk-92、nkl中依次降低。统计学显示snk-6细胞当中lmp1的表达量最高,且高于yt(p<0.001)、yts(p<0.001)、nk-92(p<0.001)、nkl(p<0.001)细胞中的表达;lmp1表达较高的是yts细胞,且高于yt(p<0.05)、nk-92(p<0.00l)、nkl(p<0.001)细胞中的表达;lmp1在yts中的表达高于nk-92(p=0.032)、nkl(p=0.018),而lmp1表达较低的nkl与nk-92两株细胞之间无统计学差异(p=0.741)。对各细胞系分别给予0、2、4、6、8gy的放疗剂量进行照射后,cck-8及平板克隆形成实验检测细胞放射敏感性显示yt、snk-6、yts、nk-92、nkl的放射敏感性依次增加。yt、snk-6对放疗不敏感,yts对放疗中度敏感,而nk-92、nkl对放疗高度敏感,差异有统计学意义。细胞中lmp1的表达量越低,其放射敏感性越高。结论:lmp1的差异表达与nk/t细胞淋巴瘤的放射敏感性负相关。第二部分:慢病毒介导稳定过表达及沉默lmp1的nk/t细胞淋巴瘤细胞株的构建目的:通过重组慢病毒表达载体构建稳定高/沉默lmp1的nk/t细胞淋巴瘤细胞株。材料与方法:选择第一部分所述5种细胞株中lmp1呈中度表达而且具有一定侵袭能力的yts细胞株,利用慢病毒pcdh-cmv-mcs-efl-copgfp作为载体,连接lmp1克隆模板pcr产物,形成高表达慢病毒载体pcdh-lmp1。设计并合成三条lmp1基因的shrna,以干扰慢病毒plvx-shrna1为载体,构建lmp1基因干扰质粒plvx-lmp1-shrnaa,plvx-lmp1shrnab,及plvx-lmp1-shrnac。real-timepcr筛选最有效的rna干扰序列。对过表达及干扰表达lmp1的重组质粒质粒进行包装,浓缩及滴度鉴定,脂质体法转染淋巴瘤细胞,测定慢病毒对淋巴细胞的感染效率。结果:酶切及测序结果显示过表达lmp1重组慢病毒质粒pcdh-lmp1及干扰表达lmp1重组慢病毒质粒plvx-lmp1-shrnaa,plvx-lmp1shrnab,plvx-lmp1-shrnac构建成功。其中plvx-shrnaa干扰效率最高,选择其进行第三部分后续实验。浓缩后的病毒滴度可达108ifu/ml。转染yts细胞系后,rt-pcr检测细胞转染效率,对相对定量结果进行t检验显示lmp1在pcdh-yts中的表达要高于yts/parental中的表达(p=0.006),结果具有统计学差异;而lmp1-shrna-yts中的表达要低于yts/parental中的表达(p=0.005)。说明瞬时转染对lmp1的表达产生影响。结论:成功构建稳定过表达及沉默lmp1的nk/t细胞淋巴瘤细胞亚株。第三部分:靶向抑制lmp1降低nk/t细胞淋巴瘤侵袭能力并提高其放射敏感性及机制分析目的:探讨慢病毒介导的lmp1-shrna干扰表达载体对nk/t细胞淋巴瘤放射敏感性的影响及机制。方法:采用能够稳定转染传代6代以上的慢病毒介导干扰lmp1表达的yts细胞亚细胞株yts-lmp1-shrna后进行x线照射,采用cck-8法和克隆形成实验检测放疗增敏效果,millicell小室实验(侵袭实验)检测侵袭能力变化,westernblot检测与侵袭相关timp-1、mmp-9蛋白,dna损伤修复通路相关蛋白ku70、dna-pkcs以及凋亡相关蛋白bcl-2、bax等表达水平的变化,从分子水平分析其放射增敏及抑制侵袭的相关机制。结果：CCK-8实验显示,PCDH-LMP1转染的细胞株与对照组相比,放射敏感性下降(P<0.001),而LMP1-shRNA转染后的细胞株与对照组相比,放疗敏感性增强(P<0.001)。克隆形成实验显示,经4GyX线照射后,LMPl-shRNA转染组存活曲线较其他各组均明显下降(P<0.01)。侵袭实验显示,单纯照射组、单纯转染shLMP1组、照射+转染shLMP1组均明显少于对照组(P<0.01);照射联合转染shLMP1组较其余各组,穿膜细胞数均明显减少(P<0.01)。进一步分析显示,除Ku-70外,其他入选蛋白在NK/T细胞淋巴瘤中都有或多或少表达,6GyX线照射可诱导YTS细胞凋亡并诱导侵袭相关蛋白MMP-9和相关蛋白Bcl-2表达降低,DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs表达增加,而LMPl-shRNA转染可增加放射诱导的细胞凋亡(P<0.01),并且可上调YTS细胞自身和放射诱导的Bax、TIMP-1蛋白表达(P<0.01),下调自身和放射诱导MMP-9、DNA-PKcs的蛋白的表达(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。结论:LMP1-shRNAl转染可减弱YTS细胞的侵袭能力,增加YTS细胞的放射敏感性,其机制可能与调控侵袭转移、凋亡及DNA损伤修复通路相关蛋白的表达量,从而增加放射诱导的侵袭转移能力和DNA损伤修复能力,增加细胞凋亡有关。