脂蛋白(a)与A群链球菌的相互作用

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:terrychang2009
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蛋白酶水解活性是许多病原生物穿越组织屏障进行扩散的重要因素,一些病原微生物可以和纤溶酶原(Plasminogen, Plg)结合,使Plg更易被宿主的纤溶酶原激活剂(plasminogen activators, PAs)激活为纤溶酶(Plasmin, Pm)而水解组织屏障,还有一些病原生物可以分泌某些PAs,进而激活吸附在其表面的Plg。因此可以说,Plg是病原菌致病的重要因子。脂蛋白(a) [Lipoprotein (a), Lp(a)]中的载脂蛋白Apo(a)与Plg有高度同源性,因此,Lp(a)可以影响纤溶系统而成为心血管疾病的独立危险因子。近年来许多报道指出,Lp(a)可以抑制Plg与其受体(如纤维蛋白原)的结合或抑制纤溶酶原的激活,因此,课题组首次提出了Lp(a)可以干扰病原菌利用纤溶酶原系统致病,指出Lp(a)可能有抗病原微生物感染的作用。A群链球菌(group A streptococcus, GAS)是人类的重要致病菌之一。人Plg是GAS致病的重要参与因子,其中GAS表面α-烯醇化酶(surface enolase, SEN)与Plg有较强的结合,本研究从M6血清型GAS菌株中克隆了SEN基因,构建了全长(SEN)和敲掉C末端赖氨酸残基(SENA434-435)的表达载体,并在大肠杆菌BL21中表达了此两种重组蛋白(rSEN,rSENA434-435)。由于在重组蛋白的N末端连有6个组氨酸的标签(His-Tag),因此利用钴离子螯合琼脂糖凝胶分离纯化了此两种重组蛋白。采用ELISA、亲和色谱层析以及Western blot实验证实rSEN能和Lp(a)结合,且6氨基己酸(EACA)可以抑制结合,而rSENA434-435不能与Lp(a)结合,说明rSEN的C末端赖氨酸残基和Lp(a)上的赖氨酸结合位点(lysine binding site,LBS)是rSEN与Lp(a)结合的位点。为了进一步验证这一结果。本研究也克隆表达了Apo(a)中含有LBS的KIV1o结构域(rKIV10)。并用ELISA证明了rKIV10可以与rSEN特异性结合,而不能与rSENA434-43结合。另外,Lp(a)与rKIV10都能够抑制rSEN与Plg的结合。因而,本研究首次从分子水平证明了Lp(a)可能干扰Plg系统而发挥抗感染作用。为了进一步探讨Lp(a)的抗感染假设,本研究进行了M6血清型GAS菌株(以下简称为M6)与Lp(a)的相互作用,证明了Lp(a)可以和M6结合,并能够抑制M6与Plg的结合和与Plg的共孵育激活,在体外证实了Lp(a)可能的抗感染作用。本研究还通过EACA抑制M6与Lp(a)的结合实验、蛋白酶K消化处理等实验初步证明了Lp(a)是通过其中的LBS与M6表面蛋白的赖氨酸结合的。但由于M6表面有多种蛋白,且Plg受体表达种类和数目也不能确定,因此未能清晰地确定M6表面的Lp(a)受体。下一步实验有望通过构建表达去除C末端赖氨酸残基的SEN的M6突变体,并进行其与Lp(a)的结合作用来进一步确定M6上的Lp(a)结合位点。总之,本研究首次证明了rSEN能够与Lp(a)结合,并明确了rSEN的C末端赖氨酸残基和Lp(a)中的LBS是其结合的主要位点。Lp(a)/rKIV10能够抑制rSEN与Plg的结合,首次从分子水平证明了Lp(a)可能干扰Plg系统而发挥抗感染作用。也对Lp(a)抗其它病原菌感染的机制探讨或感染防治提供了可能的研究思路或技术手段。本研究也首次在国际上发现Lp(a)通过其赖氨酸结合位点与M6血清型GAS结合,并能够抑制GAS与Plg的结合,开辟了Lp(a)抗感染作用研究的新途径。另外,本研究结果也为实验室提出的脂蛋白免疫学理论提供了支持。
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