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研究背景胶质瘤是成人中枢神经系统常见、生存率极低的恶性肿瘤，其手术全切率低，术后复发率高，且化疗、放疗疗效较差，是严重危害人们健康的恶性肿瘤之一。红细胞髓性致癌因子Pokemon (POK erythroid myeloid ontogenic factor)是POK (POZ and Krüppel)转录抑制因子蛋白家族成员之一，位于许多肿瘤原癌基因和抑癌基因的上游，在癌基因转化过程中起关键性作用，但目前其在胶质瘤中的表达及其生物学特性尚未探明。Survivin是已知凋亡抑制蛋白家族的新成员中重要的癌基因，在胶质瘤中普遍高表达，可以通过阻滞肿瘤细胞周期和抑制Caspase-3、Caspase-7活性来促进细胞生长和获得抗凋亡能力；细胞周期蛋白B1(CyclinB1)是由CCNB1基因编码的一个细胞周期蛋白，能有效调节高等真核生物的细胞周期，尤其是胶质瘤细胞的有丝分裂起始、中后期转换以及有丝分裂退出调控。但Pokemon对胶质瘤细胞Survivin、CyclinB1表达的调控及影响尚未明确阐明。本研究旨在探讨原癌基因Pokemon对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响；Pokemon调控Survivin、CyclinB1的表达，促进胶质瘤细胞增殖，增强细胞抗凋亡能力的分子机制。第一部分Pokemon在胶质瘤的表达及意义目的探讨人胶质瘤组织、人胶质瘤U251细胞系和人胶质HEB细胞系Pokemon的表达及其变化情况，分析Pokemon在胶质瘤中的表达与胶质瘤细胞增殖和分化的关系，明确胶质瘤Pokemon表达的生物学意义。方法收集手术切除的人胶质瘤标本35例，经病理鉴定并按WHO标准分级，以手术切除的正常脑组织18例作为对照。用免疫组化实验，RT-PCR和Western Blot方法检测Pokemon基因的mRNA和蛋白的表达，分析Pokemon表达与胶质瘤病理分级的相关性。用克隆形成实验、MTT法、细胞计数观察Pokemon表达对人胶质瘤U251细胞增殖的影响。结果正常脑组织中阳性表达率为16.7％(1/6)，细胞阳性率为3.2±3.1％。35例胶质瘤组织标本中Pokemon阳性表达率为82.8％（29/35），其中，星形细胞瘤Ⅰ级组织标本阳性表达率为60.0％(3/5)、细胞阳性率为13±8.5％；星形细胞瘤Ⅱ级组织标本阳性表达率为76.9％(10/13)、细胞阳性率为28.6±10.6％；星形细胞瘤Ⅲ级组织标本阳性率为83.3％(5/6)、细胞阳性率为44.5±7.5％；胶质母细胞瘤Ⅳ级组织标本阳性率为100.0％（11/11），细胞阳性率为59.7±17.9％。Pokemon在胶质瘤组织中的表达随着胶质瘤病理分级的增高而表达增强（p<0.05）。胶质瘤组织Pokemon mRNA和蛋白表达显著高于正常脑组织（p<0.05），胶质瘤病理分级与Pokemon表达呈正相关关系(r=0.514)。Pokemon基因沉默可显著降低U251细胞的增殖速度（p<0.05），显著减少U251细胞的克隆形成（p<0.05）。小结人胶质瘤组织、正常脑组织、U251细胞系和HEB细胞系均表达Pokemon mRNA和蛋白，人胶质瘤组织Pokemon mRNA和蛋白表达水平明显高于人正常脑组织，U251细胞系Pokemon mRNA和蛋白的表达显著高于HEB细胞系。Pokemon可作为胶质瘤病理分级的标志。Pokemon诱导人胶质瘤U251细胞增殖和单克隆的形成。第二部分Pokemon对胶质瘤细胞Survivin表达的影响及机制目的探讨胶质瘤细胞中Pokemon对Survivin表达的影响和机制及其与细胞抗凋亡能力的关系。方法用RT－PCR和Western Blot观察人胶质瘤组织、正常脑组织、U251细胞和HEB细胞Survivin的表达、在凋亡诱导药物TRAIL和CX(塞来昔布－抗肿瘤药物)预处理前后，用MTT和细胞计数观察U251细胞的增殖情况，染色质免疫共沉淀和双荧光素酶活性实验分析Pokemon与Survivin启动子结合情况及其活性的影响。结果人胶质瘤组织、正常脑组织、U251细胞和HEB细胞均表达Survivin mRNA和蛋白，人胶质瘤组织和U251细胞系Survivin mRNA和蛋白均显著高于正常脑组织和HEB细胞系（p<0.05或p<0.01）。Pokemon基因沉默可显著降低U251细胞Survivin蛋白的表达水平（p<0.05），提高U251细胞对促凋亡药物TRAIL和CX的敏感性；高表达Pokemon蛋白，可诱导Survivin蛋白的表达（p<0.05），提高U251细胞抗凋亡能力；Pokemon对U251细胞Survivin表达的诱导效应具有浓度和时间依赖性。Pokemon能与Survivin的启动子核心序列(-396~+84bp)直接结合，并激活Survivin启动子。小结人胶质瘤组织、人胶质瘤U251细胞、人胶质HEB细胞和正常脑组织均表达Survivin mRNA和蛋白，人胶质瘤组织和人胶质瘤U251细胞Survivin mRNA和蛋白的表达水平分别显著高于正常脑组织和人胶质HEB细胞。Pokemon能诱导人胶质瘤U251细胞Survivin的表达,增强人胶质瘤U251细胞对抗肿瘤药物的耐受性和抗凋亡能力。Pokemon能结合Survivin启动子核心序列(-396~+84bp)，并激活Survivin启动子，诱导Survivin的表达。第三部分Pokemon对胶质瘤细胞CyclinB1表达的影响及机制目的探讨胶质瘤细胞中Pokemon对CyclinB1表达的影响和机制及其与细胞增殖的关系。方法用MTT和细胞计数观察U251细胞的增殖情况，用流式细胞技术分析细胞周期，用RT－PCR和Western Blot观察U251细胞CyclinB1的表达，双荧光素酶活性实验分析Pokemon与CyclinB1启动子活性的影响。用柔红霉素预处理细胞，观察沉默CyclinB1基因后，U251细胞对柔红霉素的敏感性的影响。结果人胶质瘤U251细胞和胶质细胞HEB均表达CyclinB1mRNA，人胶质瘤U251细胞CyclinB1mRNA的表达水平显著高于胶质HEB细胞。Pokemon高表达，U251细胞CyclinB1mRNA的表达水平显著增高（p<0.05），Pokemon基因沉默，U251细胞CyclinB1mRNA的表达水平显著降低（p<0.01），Pokemon对CyclinB1表达的诱导效应具有时间依赖性，Pokemon可激活胶质瘤U251细胞CyclinB1启动子。沉默CyclinB1基因能抑制U251细胞的增殖（p<0.05），诱导U251细胞增殖阻滞在G2/M期，提高了胶质瘤U251细胞对柔红霉素敏感性（p<0.05）。小结胶质瘤U251细胞系和HEB细胞系均表达CyclinB1，U251细胞系CyclinB1表达水平显著高于HEB细胞系。Pokemon可激活CyclinB1的启动子，诱导胶质瘤U251细胞CyclinB1的表达。siRNA-CyclinB1诱导胶质瘤U251细胞增殖阻滞在G2/M期，提高胶质瘤U251细胞对柔红霉素敏感性。结论1.原癌基因Pokemon、Survivin及CyclinB1在人胶质瘤组织和U251胶质瘤细胞中高表达。原癌基因Pokemon高表达可作为胶质瘤细胞病理分级的重要标记。2. Pokemon通过激活Survivin和CyclinB1启动子，诱导胶质瘤U251细胞Survivin和CyclinB1的表达。3.人胶质瘤U251细胞高表达的Pokemon可诱导Survivin和CyclinB1的表达，提高胶质瘤细胞的抗凋亡能力，促进U251细胞增殖。