哺乳动物卵巢中含有不同发育阶段的卵泡和黄体,具有产生卵细胞并释放成熟卵细胞的功能。卵巢合成并分泌的激素是卵泡生长、维持正常的生殖周期和生殖能力、雌性第二性征发育和代谢功能所必需的。哺乳动物出生后,原始卵泡的数目就不会再增加。在原始卵泡形成后,休眠的原始卵泡会有序地被激活,又称作启动募集。在青春期后,有腔卵泡周期性地在促卵泡激素的作用下继续发育至成熟卵泡,此过程称作周期募集,未能进入周期募集的有腔卵泡会发生闭锁。发育至成熟的卵泡会在黄体生成素的作用下发生排卵,卵细胞排出后剩余的卵泡膜细胞和颗粒细胞会形成黄体。由于卵泡激活和发育的过程是不可逆的,若卵泡激活的过程失控,则会引起卵泡在生命早期即被耗尽,发生卵巢早衰。卵巢早衰会产生失去生育能力等症状,是女性不孕的原因之一,严重影响女性身心健康。本实验室前期研究发现CUL4B基因突变导致X连锁智力低下综合征,患者除智力障碍外,还表现出语言和运动发育迟缓、肥胖、身材矮小、性腺功能减退等症状。CUL4B是Cullin蛋白家族成员,Cullin蛋白是一类重要的骨架蛋白,参与构成真核生物中最大的一类泛素连接酶复合物Cullin-RING E3连接酶复合物。CUL4B蛋白作为骨架蛋白参与构成Cullin 4B-RING E3泛素连接酶复合物(简称CRL4B复合物),其C末端与Ring蛋白Rbx/ROC结合,从而招募E2泛素结合酶,N末端则与连接蛋白DDB1结合,DDB1进一步与底物受体蛋白(DCAF)结合,通过DCAF特异性地结合底物蛋白。CRL4B复合物既可以催化底物多泛素化介导蛋白酶体途径降解,也可以通过表观遗传学方式调控基因表达,在多种组织、多种病理生理过程中发挥重要作用。为阐明CUL4B基因的生理功能及其在X连锁智力低下综合征发生过程中的作用机制,本实验室前期利用Cre/loxp系统建立了 Cul4b基因敲除小鼠模型。研究结果发现,Cul4b基因全身性敲除小鼠在胚胎早期表现出严重的发育停滞,并且在胚胎发育9.5天之前死亡。随后又利用小鼠模型阐明了 Cul4b基因在神经系统发育、小鼠髓系细胞分化、脂肪细胞分化、胰岛delta细胞发育中的作用。CUL4B基因突变会引起患者出现性腺功能减退的症状,提示CUL4B有可能在生殖系统中发挥重要作用。研究表明,全身性(Sox2-Cre)或生殖细胞特异性(Vasa-Cre,即Ddx4-Cre)敲除Cul4b基因可以引起雄性小鼠不育。CRL4A/B复合物的其他成员在卵巢发育中发挥重要的作用。在卵母细胞发育的不同阶段敲除Ddb1、Dcaf1、Dcaf13等基因可以分别导致卵巢早衰或早期胚胎发育异常。以上结果提示CUL4B可能在卵巢发育过程中发挥重要作用。本研究将通过在激活后卵泡的卵母细胞中敲除Cul4b基因,研究CUL4B在卵巢发育中的作用。为获得在激活卵泡的卵母细胞中特异性敲除Cul4b基因的小鼠,我们将实验室前期构建的Cul4bflox/flox基因打靶小鼠与Zp3-Cre+/-转基因小鼠交配,构建了Zp3-Cre;Cul4bflox/flox基因敲除雌鼠模型。CUL4B免疫组化结果显示,在不同周龄的野生型雌鼠的卵母细胞的细胞核中存在CUL4B的表达,而在Zp3-Cre;Cul4bflox/flox雌鼠的卵巢中,原始卵泡中仍然存在CUL4B的染色,但在初级卵泡和之后时期的卵母细胞中则没有CUL4B染色,证明在Zp3-Cre;Cul4bflox/flox雌鼠中激活卵泡的卵母细胞中的CUL4B已被敲除。生育能力测试结果显示Zp3-Cre;Cul4bflox/flox雌鼠丧失生育能力,提示CUL4B在小鼠雌性生殖中发挥重要的作用。为寻找Zp3-Cre;Cul4bflox/flox雌鼠丧失生育能力的原因,我们首先进行了小鼠卵巢组织的形态学分析。H&E染色和MVH、FOXO1免疫组化结果表明,不同周龄的Zp3-Cre;Cul4bflox/flox雌鼠的卵巢大小和形态没有发生明显的变化,各种卵泡的数量、大小、形态与同窝对照雌鼠相比均没有明显区别,同时在性成熟后的敲除鼠的卵巢中黄体的结构和数量与同窝对照雌鼠相比无明显差异,提示Zp3-Cre;Cul4bflox/flox雌鼠的排卵功能没有异常。TUNEL染色结果也显示Zp3-Cre;Cul4bflox/flox雌鼠的卵母细胞没有出现更多的凋亡。以上结果提示在激活卵泡的卵母细胞中敲除Cul4b基因对初级卵泡发育至排卵过程没有显著的影响,Zp3-Cre;Cul4bflox/flox雌鼠失去生育能力可能是由于胚胎发育异常导致的,下一步将进一步从早期胚胎发育角度进行分析。为分析Zp3-Cre;Cul4bflox/flox基因敲除雌鼠丧失生育能力的分子机制,我们分析了基因敲除雌鼠卵巢组织中蛋白质和mRNA的表达变化。Western blot实验结果发现,Zp3-Cre;Cul4bflox/flox基因敲除雌鼠的卵巢组织中蛋白磷酸酶PP2A的A亚基(PP2A-A)和C亚基(PP2A-C)的表达量降低。实时定量PCR实验结果发现,体外培养的卵巢组织中敲低Cul4b基因导致Figla、Nobox等基因的表达量升高。此外,在体外培养的颗粒细胞中敲低Cul4b基因后,与对照细胞相比形态未发生明显变化,但EdU掺入实验结果显示敲低Cul4b的颗粒细胞的增殖能力明显降低。综上,本文构建了激活卵泡的卵母细胞特异性敲除Cul4b基因小鼠模型,并发现敲除Cul4b导致小鼠丧失生育能力,但目前对导致生育能力丧失的机制尚不清楚,有待进一步研究。