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研究目的观察经方膈下逐瘀汤对肝癌Bel-7402细胞和大鼠肝癌组织中第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homologue deleted fromchromosome 10，PTEN)编码的蛋白及其磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)-丝／苏氨酸激酶(serine threonine kinase，Akt)信号转导通路相关蛋白的表达的影响，从而寻找PTEN蛋白与PI3K蛋白、磷酸化Akt的相关性，试图进一步阐明膈下逐瘀汤抗肝癌的可能发生机制。研究方法一、体外实验将20只正常Wistar大鼠随机分为4组，每组5只：正常对照组、顺铂组、膈下逐瘀汤组、联合治疗组，顺铂配制成浓度为0.300mg／ml的药液；膈下逐瘀汤经煮沸、过滤配成浓度分别为0.740g／ml的药液灌胃7天，对照组大鼠给予生理盐水，制备含药血清及正常大鼠血清。将Bel-7402细胞传代并培养，分组给予药物血清培养基以及正常大鼠培养基培养细胞。采用甲基噻唑基四唑(methylthiazolylium，MTT)比色法检测正常血清组、膈下逐瘀汤组、顺铂组、联合治疗组对Bel-7402细胞生长的影响，用酶标仪测定培养细胞在570nm处吸光度值，并计算细胞抑制率。蛋白印迹试验(Western blotting analysis，WB)检测Be1-7402细胞不同时间PTEN蛋白、PI3K蛋白及磷酸化Akt的表达水平，及各治疗组对PTEN蛋白、PI3K蛋白及磷酸化Akt的表达水平的影响。二、体内实验将雄性Wistar大鼠随机分为5组：正常对照组，肝癌模型组，顺铂组，膈下逐瘀汤组，联合治疗组。每组7只大鼠。造模参考吴仕九、王锦波方法，腹水型Walker-256肿瘤细胞株注射入大鼠皮下，长出皮下实体瘤，取瘤体周边鱼肉样组织剪成约2mm~3小块，实验组大鼠麻醉后，剖开腹腔，暴露肝脏，以眼科镊将瘤块植入肝脏包膜下，用可吸收凝胶海绵塞填压迫，防止瘤块脱出及出血，关闭腹腔，术后注射青霉素针剂(20万U／d，连续3天)。正常对照组不造模，予普通饲料饲养，置于普通环境。正常对照组和肝癌模型组不给药；膈下逐瘀汤组大鼠给予膈下逐瘀汤水煎剂灌胃，0.740g／ml，每天1次，连续15d；顺铂组大鼠给予顺铂腹腔注射，0.300mg／ml，隔天1次，共7次；联合治疗组大鼠给予膈下逐瘀汤和顺铂联合治疗，剂量及用法同上述两组。至造模第20天处死所有动物，取新鲜肝组织迅速置于液氮中保存。采用Western blotting analysis检测肝癌组织正常组、肝癌模型组、顺铂组、膈下逐瘀汤组、联合治疗组对PTEN蛋白、PI3K蛋白及磷酸化Akt的表达水平。研究结果①48h时不同药物血清治疗组对Bel-7402细胞增殖影响的结果经单因素方差分析显示：F=1834.977，P=0.000，组间采用LSD方法，与正常对照组细胞增殖的A值比较，顺铂治疗组、膈下逐瘀汤组和联合治疗组差异均有显著性意义(P=0.000，P＜0.01)；与顺铂治疗组比较，膈下逐瘀汤组有差别(P=0.048，P＜0.05)，联合治疗组有显著性意义(P=0.000，P＜0.01)；膈下逐瘀汤组和联合治疗组相比，其差异亦有显著性意义(P=0.000，P＜0.01)。②72h时不同药物血清治疗组对Bel-7402细胞增殖影响的结果经单因素方差分析显示：F=3737.239，P=0.000，组间采用LSD方法，与正常对照组细胞增殖的A值比较，顺铂治疗组、膈下逐瘀汤组和联合治疗组差异均有显著性意义(P=0.000，P＜0.01)；与顺铂治疗组比较，膈下逐瘀汤组有差别(P=0.020，P＜0.05)，联合治疗组有显著性意义(P=0.000，P＜0.01)；膈下逐瘀汤组和联合治疗组相比，其差异亦有显著性意义(P=0.005，P＜0.01)。③膈下逐瘀汤作用Bel-7402细胞30min后，PTEN蛋白水平较正常血清组增高，至3hPTEN蛋白水平达到最高水平，到6h时PTEN蛋白恢复至原来水平；与正常对照组，顺铂组比较，联合治疗组、膈下逐瘀汤组药物作用肝癌Bel-7402细胞3h后PTEN蛋白的表达均有明显差异，而联合治疗组治疗作用较膈下逐瘀汤组更为明显。④膈下逐瘀汤作用Bel-7402细胞5min后，P13K蛋白水平较正常血清组降低，至10minPI3K蛋白水平降至最低水平，30minPI3K蛋白水平有所上升，至60minPI3K蛋白恢复至原来水平；与正常对照组比较，各组药物作用肝癌Bel-7402细胞10min后PI3K蛋白的表达均有差异，但联合治疗组治疗作用最为明显，次之为膈下逐瘀汤组，最后为顺铂组。⑤膈下逐瘀汤作用Bei-7402细胞10min后，P-Akt蛋白水平开始逐渐降低，至30min P-Akt蛋白水平降至最低水平，至60min P-Akt蛋白与正常血清组无显著差异。与正常对照组比较，各组药物作用肝癌Bel-7402细胞30rain后P-Akt蛋白的表达均有差异，但联合治疗组治疗效果最为显著，次之为膈下逐瘀汤组，最后为顺铂组。⑥Western Blot法检测大鼠肝癌组织PTEN蛋白的结果：与正常对照组相比，肝癌模型组、顺铂治疗组、膈下逐瘀汤和联合治疗组PTEN蛋白表达均增高；与肝癌模型组相比，顺铂治疗组、膈下逐瘀汤和联合治疗组的PTEN蛋白表达显著增高，有明显差异；与顺铂治疗组比较，膈下逐瘀汤和联合治疗组的表达增高，但联合治疗组差异更为显著。⑦用Western Blot法检测大鼠肝癌组织PI3K蛋白表达情况：正常组不表达PI3K蛋白；与肝癌模型组相比，顺铂治疗组、膈下逐瘀汤和联合治疗组PI3K蛋白表达均有所降低，有明显差异；与顺铂治疗组比较，膈下逐瘀汤和联合治疗组的PI3K表达水平有差异，但联合治疗组差异更为显著。⑧用Western Blot法检测大鼠肝癌组织P-Akt蛋白表达情况：正常组不表达P-Akt蛋白；与肝癌模型组相比，顺铂治疗组、膈下逐瘀汤和联合治疗组P-Akt蛋白表达均有所降低，有明显差异；与顺铂治疗组比较，膈下逐瘀汤和联合治疗组的P-Akt表达水平有差异，但联合治疗组差异更为显著。结论①膈下逐瘀汤能抑制肝癌Bel-7402细胞的增殖；②PTEN蛋白水平的增高可能是膈下逐瘀汤抗肝癌的主要作用机制之一；③PI3K／Akt信号转导通路相关蛋白PI3K、P-Akt水平的降低可能是膈下逐瘀汤抗肝癌的主要作用机制之一；④PTEN与PI3K／Akt信号转导通路的相关性蛋白PI3K、P-Akt可能互相拮抗；⑤膈下逐瘀汤与抗肿瘤药顺铂有协同作用。