玉米(Zea mays L.)作为世界上分布最广泛的作物之一,其用途广泛,不仅可以作为人类口粮,还可以作为牲畜饲料及工业生产原料。由于居民饮食结构中肉类的比例逐渐上升,极大地促进了养殖业的发展。随着养殖业的快速发展,对饲料的需求逐年攀升。玉米还可用于工业原料,生产淀粉,氨基酸和乙醇等,这带动了玉米种植面积和总产量的稳步上升。然而在世界范围内玉米需求仍在持续增长,但供给情况并不乐观。因此积极展开玉米的分子遗传学研究,为玉米遗传育种工作提供材料和基因资源,就显得十分必要和迫切。然而玉米的分子遗传学研究离不开转基因和大量的突变体材料。另外玉米的株型较大不适合大规模温室生长,生长周期较长等特点限制了玉米基因功能研究的发展。二穗短柄草(Brachypodium distachyon L.)与大麦,小麦,玉米等禾本科作物亲缘关系较近,它们都是单子叶植物,另外二穗短柄草的基因组小,生长周期短,生长条件也简单及自花授粉等特点使其成为了研究禾本科单子叶植物的模式材料。为了更好地开展玉米功能基因组学研究,本文致力于建立高效,可重复的玉米遗传转化体系和Ac/Ds标签突变体库,创造大量突变体材料,为玉米基因的发掘,功能注释及其分子机理研究奠定基础和提供材料;同时我们也对相关突变体及其相关基因在二穗短柄草中的功能做初步分析,为各物种间基因功能的分子及进化关系研究提供思路。玉米遗传转化体系的建立(1)基因枪介导的玉米遗传转化在玉米遗传转化研究工作中,人们通常使用未成熟胚或其胚性愈伤组织作为转化受体,抗生素或除草剂筛选产生抗性愈伤组织和抗性芽。玉米的抗性愈伤组织和抗性芽中往往会存在比例不等的假阳性现象,显著地增加了组织培养和后期分子鉴定的工作量。利用GFP(Green Fluorescence Protein)绿色荧光蛋白基因作为辅助性筛选标记基因,基因枪法轰击了玉米自交系A188和Qi319未成熟胚的胚性愈伤组织。瞬时表达实验结果表明,轰击后GFP表达可持续近3w,轰击后10d左右表达量仍保持在较高的水平。采用潮霉素筛选,GFP荧光法鉴定,获得了一批玉米转基因植株,转化频率0.3-0.5%。分子鉴定和后代分析的结果表明,外源基因已经整合到了玉米基因组中并能够稳定地表达和遗传。这一工作揭示了GFP作为辅助性筛选标记基因可以直观、快速和有效地消除玉米遗传转化工作中的假阳性现象。(2)农杆菌介导的玉米遗传转化在以未成熟胚为受体,农杆菌介导的玉米遗传转化研究中,MS或N6共培养基(MC)常常被用来培养侵染后的玉米未成熟胚。在这里,我们描述了一种新的共培养方法—干滤纸共培养法(农杆菌侵染后的玉米未成熟胚放置于垫有两张干滤纸的培养皿中培养,DC),同时我们以来源于Qi319玉米自交系的未成熟胚为受体,通过农杆菌介导玉米的遗传转化。为了检测这两种共培养法(MC和DC)对玉米转化效率的影响,我们设计了三组实验:(1)使用AGL1菌株分别携带两种独立的质粒(pXQD12和pXQD70)侵染玉米9-15d的未成熟胚;(2)使用两个不同菌株(AGL1和EHA105)携带同一载体(pXQD12)分别侵染玉米9-15d的未成熟胚;(3)用携带(pXQD12或pXQD70)质粒的(AGL1或EH105)菌株分别侵染玉米9-15d的未成熟胚,侵染不同时间(5min,10min,15min,20min和25min)。然后,侵染过的未成熟胚分别放置于仅垫有两张滤纸的培养皿或MS共培养基上进行培养,余下转化过程同普通的转化过程一样。结果显示,和MC相比,侵染后8d(3d共培养,5d天恢复培养)对愈伤组织在体视镜下进行GFP观察,%GFP~+愈伤组织(GFP~+愈伤组织占所侵染的未成熟胚的百分率)增加约2-3倍。另外,与MC相比,DC的平均再生效率(%GFP~+再生的愈伤组织占所侵染的未成熟胚的百分率)和稳定转化效率(%GFP~+植株占所侵染的未成熟胚的百分率)也显著提高。总之,DC共培养法也许能用于发展一种更为有效的农杆菌介导的玉米遗传转化。玉米Ac/Ds标签突变体库的构建与分析玉米是一个对C4植物进行分子和农艺研究的模式材料。本项研究利用转座子标签载体—激活(Ac)/解离(Ds)-ATag_ubiGFP在玉米Qi319中产生插入标签和敲除型突变体。该载体携带新霉素磷酸转移酶基因(NPTII),绿色荧光蛋白(GFP)基因和由35S启动子启动的玉米转座酶(TPase)基因。利用该载体转化玉米产生了4个外源Ds(foreign Ds,fDs)发生转座的T0转基因系。在T0和T1代时,将转基因与野生型杂交,共获得12,514个单株。使用绿色荧光蛋白(GFP)和多重聚合酶链反应(PCR)筛选该群体。通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)或反向PCR(iPCR)鉴定fDs-ATag元件转座位置的边界,并将得到的产物序列与最近报导的玉米基因组进行比对。到目前为止,我们已经获得在10条玉米染色体都有分布的154个独立的仅fDs转座群体。这些群体已经以种子的形式在种子库中保存下来,这样人们可以通过对在线数据库进行访问,为商业玉米品种背景下的基因功能分析和育种提供了独特的资源。二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步研究在上述Ac/Ds突变体库中,我们发现了一个可能由于fD插入造成的晚花突变体。经过分子及生物信息学分析,该突变体中fDs插入到基因号为NP001105152的玉米基因的第一个外显子上且该基因与二穗短柄草BdSOC1-like基因同源。由于玉米生长周期较长,株型较大不适合温室大规模生长等特点,为了能快速的研究上述基因号为NP001105152的玉米基因的功能,同时也想看看温带禾本科植物中该同源基因的功能,我们使用与小麦和水稻亲缘关系较近且生长周期较短的模式植物二穗短柄草Bd21为研究材料,对BdSOC1-like的功能进行初步分析。生物信息学分析显示该BdSOC1-like具有SOC1家族所特有的MADS-box和kerati(k)结构域。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果暗示了,BdSOC1-like基因在植物根、茎、幼叶、老叶、顶端分生组织和花中都有表达,在长日照(LD,18h light/6h dark)或短日照(SD,10h light/14h dark)条件下,BdSOC1-like的mRNA积累并没有昼夜节律性以及BdSOC1-like的表达也对持续的冷处理没有记忆性。另外在二穗短柄草中超表达BdSOC1-like不但引起了植物提前开花,也导致了较弱的种子表型。总的来说,以上结果暗示了,在二穗短柄草中,BdSOC1-like在植物的成花转变中也许扮演着重要的角色。总之,本研究改进了玉米遗传转化方法,建立了Ac/Ds转座体系,并对玉米在短柄草中的一个与花期相关的同源基因进行了功能分析,获得了3方面的创新性结果:(1)在基因枪转化中建立了一种GFP标签鉴定方法,使转基因后代鉴定更快速便捷。在农杆菌转化中建立了干滤纸共培养法,使转化效率大幅度提高;(2)建立了玉米Ac/Ds转座系统,获得了转座位点分布在10条染色体上的154个fDs转座系;(3)发现一个晚花突变体,分析了突变基因,进而在短柄草基因组中找到了同源基因BdSOC1-like,并利用转基因方法进行了功能验证。