新型高活性醒酒保肝玉米肽的制备、活性与结构

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生物活性肽类物质对人类的健康起着有益的作用。本研究以玉米生产淀粉的副产物——黄粉为原料,利用碱性蛋白酶Alcalase制备了具有醒酒保肝活性的玉米蛋白酶解液,用超滤技术对该酶解液进行分级分离,通过测定体外/体内活性来筛选高醒酒活性的级份,探讨其醒酒机理。并进一步利用四氯化碳(CCl4)诱导肝损伤模型考察了高醒酒活性级份的保肝效果及其机理。并通过液质联用技术鉴定玉米肽(CP)的一级结构,并探讨其构效关系。本文还对超滤/纳滤技术制备纯化玉米肽的条件进行了优化,为大量制备高活性醒酒保肝玉米肽提供依据。本文主要研究结果如下:1.玉米粗肽的制备及其分子量分布  碱性蛋白酶Alcalase酶解玉米蛋白的最佳酶解条件为:酶解时间为5 h,加酶量为0.1536 U/g,料液比为1:25。该酶解液多肽级份的分子量(Mw)集中在4540 Da左右;而除去Mw>10 kDa的部分后,玉米肽分子量则主要集中在3320 Da左右。2.玉米粗肽的分级分离及醒酒机理  (1)Mw3-5 kDa CP具有最高的体外·OH抑制活性(IC50=1.89 mg/mL)、最大的疏水值Q值(6.01 kj/mol)和最低的F值(2.79);Mw<1 kDa CP具有最高的体外激活乙醇脱氢酶(ADH)的能力,激活率达170.83%,Ala和Leu两种氨基酸残基含量占该级份总氨基酸残基(27.50%)及在疏水氨基酸残基中的比例均最高(52.16%);Mw<5 kDa玉米肽具有最高的F值(3.10)以及最大的清除小鼠血醇活性,灌胃200 mg/kg.bw的该级份玉米肽时,血醇清除率与对照组相比降低了45.1%;玉米肽F值与其体内清除血醇的能力呈一定的正相关关系(r=0.8067)。  (2)玉米肽醒酒的机理:低分子量的疏水性玉米肽直接激活ADH,加速酒精在体内的代谢,同时玉米肽的·OH清除能力对缓解酒精代谢引起的氧化应激起到协同作用。  3.玉米肽对小鼠四氯化碳诱导肝损伤的保护作用及机理  Mw<5 kDa玉米肽对小鼠 CCl4诱导的急性肝损伤具有明显的保护作用,200 mg/kg.bw的玉米肽给药的保肝效果与50 mg/kg.bw水飞蓟宾接近;玉米肽的保肝机理与其清除自由基活性、还原性及高F值有关。  4.超滤/纳滤技术分离纯化玉米肽  (1)玉米蛋白酶解物过截留分子量(MWCO)为5 kDa超滤膜:随着时间的增加,在各试验酸度下(pH6、7、8、9),超滤膜通量和传质率(Tr)不断下降,而浓缩体积倍数(VCF)不断增加;而同一时间,随着 pH的增加,膜通量、VCF和玉米肽得率逐渐增加。故碱性条件下(pH8~9)对玉米蛋白酶解液进行超滤效果最好。  (2)在对Mw<5 kDa玉米肽液的纳滤浓缩过程中,MWCO为360 Da纳滤膜对玉米多肽、游离氨基酸及Na+均具有较高的传质率。MWCO为160 Da纳滤膜对玉米肽的截留率在88.80%以上(脱盐效果与MWCO为360 Da相当),并能脱除游离氨基酸,活性肽损失较少,多次透析纯化仍能较好地保持了玉米肽的抗氧化活性及对ADH的激活作用。综合考虑玉米肽活性保持、脱盐及能耗,宜选用MWCO为160 Da纳滤膜对玉米肽液进行浓缩纯化,透析过滤次数以3次为宜。  5.玉米醒酒保肝肽的一级结构研究(Mw<5 kDa)  利用液质联用技术结合在线串联质谱数据库检索,确定了6种玉米肽的一级结构:肽1:KPFIT或KPFLT;肽7:QLLPF;肽9:HSIPF或SHLPF;肽10:EEIPF。均为疏水性短肽,其中疏水性氨基酸及碱性氨基酸(L、I、P、F、K和H)对醒酒保肝活性有贡献。
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